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Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 1539 (2023) Citar este artículo

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Los procesos de fosilización y especialmente el papel de la actividad bacteriana durante la conservación del material orgánico aún no se han entendido bien. Aquí, informamos los resultados de experimentos tafonómicos controlados con cangrejos de río en agua dulce y sedimentos. Los análisis de amplicón de ARNr 16S mostraron que el desarrollo de la composición de la comunidad bacteriana a lo largo del tiempo se correlacionó con diferentes etapas de descomposición y conservación. Se identificaron tres géneros dominantes, Aeromonas, Clostridium y Acetobacteroides, como los principales impulsores de la descomposición del cangrejo de río en agua dulce. Usando tomografía computarizada (µ-CT), microscopía electrónica de barrido (SEM) y espectroscopía Raman confocal (CRS), se detectaron grupos de calcita después de 3 a 4 días dentro de los cadáveres de cangrejos de río durante su descomposición en agua dulce a 24 °C. La precipitación de agregados de calcita durante el proceso de descomposición se incrementó en presencia del género bacteriano Proteocatella. En consecuencia, Proteocatella podría ser uno de los géneros bacterianos responsables de la fosilización.

"Konservat-Lagerstätten" alberga un registro fósil de tejido blando distinto y, por lo tanto, representa la diversidad de comunidades antiguas1,2. Los diferentes pasos que conducen a la fosilización de los tejidos blandos siguen sin estar claros y, especialmente, el papel de la actividad bacteriana no se comprende bien. Inmediatamente después de la muerte de un organismo, enzimas autolíticas, como lipasas, proteasas o amilasas, inician la autodigestión de las células muertas y se liberan líquidos ricos en nutrientes3,4,5,6. Estos nutrientes apoyan el crecimiento inicial de bacterias que luego producen exoenzimas hidrolíticas y continúan descomponiendo la materia orgánica. La descomposición heterotrófica puede ir acompañada de cambios en el valor del pH. Se supone que estos cambios de pH podrían resultar en la liberación de iones del material orgánico y el entorno circundante. Los iones libres perjudican aún más el crecimiento bacteriano, conducen a una estabilización de los restos de tejido y, eventualmente, a una mineralización autógena7,8,9,10,11,12,13. Por lo tanto, la actividad bacteriana inicial parece desempeñar un papel importante para la conservación excepcional14,15 siempre que la tasa de los procesos de conservación posteriores, por ejemplo, la mineralización, siga siendo más alta que las tasas de descomposición7,8,9,10,11,12,14, 16,17,18,19,20.

La mayor parte de la investigación se centra en las condiciones ambientales que reducen la actividad bacteriana o favorecen la precipitación de minerales. La actividad bacteriana está muy influenciada por factores abióticos, como la temperatura, el valor de pH, la salinidad o el oxígeno. Estos parámetros afectan la capacidad de las cepas para colonizar con éxito un hábitat o regular la producción de exoenzimas degradantes específicas según la disponibilidad de nutrientes, oxígeno, densidad de células bacterianas y fase de crecimiento bacteriano21,22,23. Exoenzimas como proteasas, quitinasas o lipasas contribuyen a la descomposición de los tejidos blandos, mientras que otras características metabólicas bacterianas (p. ej., actividad de ureasa, metabolismo de aminoácidos, fermentación de azúcares con liberación de ácidos orgánicos) pueden inducir directa o indirectamente procesos de mineralización24 y, por lo tanto, contribuir a la preservación de los tejidos blandos. Se supone que la descomposición y la mineralización ocurren simultáneamente y son específicas del tipo de tejido13,25. La preservación del tejido blando a menudo se ha asociado con condiciones anaeróbicas que reducen la actividad autolítica y se supone que influyen en la degradación microbiana26,27,28,29,30,31,32,33,34,35. Sin embargo, esto no considera que las bacterias exhiban varias adaptaciones a condiciones de oxígeno reducido. Por ejemplo, Pseudomonas tunicata, una bacteria marina aeróbica, formará pseudomorfos de embriones marinos en condiciones aeróbicas, pero destruirá la estructura interna de las células si el oxígeno no está disponible o se agota31. Además, algunos organismos anaeróbicos obligados, como las bacterias sulfato-reductoras, pueden degradar la materia orgánica tan rápido como las bacterias aeróbicas16,36. Además, los experimentos tafonómicos todavía no llegaron a un consenso sobre el papel de las condiciones anaeróbicas en la conservación. Mientras que algunos resultados indican una descomposición más rápida de los tejidos blandos en condiciones aeróbicas26,27,28,37, otros resultados experimentales no muestran diferencias en comparación con la descomposición anaeróbica16,38 o solo diferencias raras en diversas condiciones de oxígeno39,40. En especial, un estudio destacó que algunos tejidos cnidarios se descomponen aún más rápido en condiciones anaeróbicas41. También se ha sugerido que los procesos de mineralización específicos inducidos por bacterias en condiciones anaeróbicas podrían ser más importantes para la conservación de tejidos que la reducción de la actividad microbiana14.

Actualmente, solo hay un conocimiento muy limitado sobre el impacto de especies individuales en los procesos de descomposición y conservación y su origen, ya sea del microbioma animal (flora gastrointestinal/tegumentaria) o del biotopo en el que murió el animal (medio ambiente). Los primeros resultados indicaron una influencia estabilizadora de microorganismos endógenos, presumiblemente de la flora gastrointestinal de organismos bilaterales34, mientras que Eagan35 destacó que cada organismo exhibe un microbioma individual que puede apoyar la conservación o acelerar la descomposición. Por lo tanto, los experimentos tafonómicos controlados y cuidadosamente diseñados que se centran en la actividad microbiana y los cambios orgánicos asociados en diferentes condiciones ambientales son necesarios para obtener una comprensión detallada de los procesos de descomposición. La investigación de los procesos de descomposición ofrece la oportunidad de identificar las fases de descomposición que deben ser suprimidas o que deben tener lugar para generar las condiciones específicas necesarias para la preservación de los tejidos blandos.

Con este estudio, queremos contribuir a la elucidación de la compleja interacción entre la descomposición y la conservación que allana el camino hacia un fósil excelentemente conservado. Este es el primer enfoque experimental que analizó el cambio dependiente del tiempo de la composición de la comunidad bacteriana durante la descomposición o la conservación de los cadáveres de Cambarellus diminutus en experimentos tafonómicos de agua dulce controlados mediante el análisis de amplicón de ARNr 16S. Para dilucidar el papel de la flora intrínseca y extrínseca en la degradación o preservación de los tejidos blandos, los cangrejos de río se incubaron en agua y sedimento de lago natural a 24 °C. El agua del lago esterilizada en autoclave y los sedimentos sirvieron como controles. Se utilizaron condiciones anaeróbicas y aeróbicas para estudiar la influencia de la anoxia en los procesos de descomposición y conservación potencial (Fig. 1).

Diseño de montaje experimental realizado a una temperatura constante de 24 °C. Exp. 1 se realizó en condiciones aeróbicas con agua y sedimentos sin tratar. Exp. 2 se realizó en condiciones aeróbicas con agua estéril y sedimento. Exp. 3 se realizó en condiciones anaeróbicas con agua y sedimentos sin tratar. Exp. 4 se realizó en condiciones anaeróbicas con agua estéril y sedimento.

Se tomaron individuos del cangrejo de río actual Cambarellus diminutus [Hobbs 1945] de una comunidad de tanques de cría criada en nuestro laboratorio. Los animales se mantuvieron en tanques de 54 L de 60 × 30 × 30 cm de tamaño, a una temperatura constante del agua de 26 °C. Los tanques se llenaron con agua de tubería y se fortificaron con acondicionador de agua "Biotopol C" (JBL, GmbH & Co. KG, Neuhofen, Alemania) para neutralizar el zinc (Zn) y el plomo (Pb) y eliminar el cloro (Cl) y unir el cobre ( Cu). Los cangrejos de río se alimentaron con nada más que "Crabs Nature" (Sera, GmbH, Heinsberg, Alemania), un alimento principal para los cangrejos de río (los ingredientes se pueden encontrar en la Tabla complementaria 1.

Se sacrificaron 144 individuos con intestinos parcialmente llenos colocándolos en una atmósfera de dióxido de carbono (CO2). Las muestras no se secaron antes de pesarlas en una microbalanza. Las longitudes se midieron desde la punta anterior del cefalotórax hasta el final del pleon sin el telson (Tabla complementaria 2a, b). La información sobre la posición zoológica sistemática y la construcción general de la cutícula de Cambarellus diminutus y el ciclo de muda se proporciona en la información complementaria (Figuras complementarias 1 y 2).

En el estudio, se realizaron cuatro configuraciones experimentales diferentes a una temperatura constante de 24 ° C (Fig. 1 y Fig. 3 complementaria). Se iniciaron dos experimentos con condiciones aeróbicas, por lo que un experimento se realizó con agua de lago y sedimentos sin tratar (Exp. 1) y el otro con agua y sedimentos estériles (Exp. 2). También se realizaron otros dos experimentos con sedimentos y agua no tratados (Exp. 3) y estériles (Exp. 4), pero se establecieron condiciones anaeróbicas a través de sistemas específicos de generación de gas (Fig. 1).

Para todos los experimentos, se llenaron 184 tubos Falcon estériles (50 mL) con ~ 6 g de sedimento cerca de la costa, tomados de un lago de agua dulce llamado "Alte Tongrube" en Bonn-Röttgen, Alemania (50°40′24.7″N/7°04 ′29.6″E). Se colocaron 144 especímenes cada uno sobre el sedimento en uno de estos tubos Falcon y 40 tubos Falcon quedaron sin un espécimen de cangrejo de río y sirvieron como muestras en blanco. Todos los tubos se llenaron con ~ 40 mL de agua de lago, tomada de la misma localidad. Para los experimentos estériles (Exp. 2 y 4), el agua y el sedimento se esterilizaron en autoclave durante al menos 20 min a 121 °C. Todos los experimentos se establecieron bajo una campana de flujo laminar. Se prepararon experimentos en condiciones iniciales anaeróbicas (Exp. 3 y 4) con la adición de β-mercaptoetanol 10 mM (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, GER) como agente reductor. Las condiciones anaeróbicas se establecieron con sistemas de generación de gas BD Difco™ GasPak™ EZ Anaerobier Pouch System (BD Becton, Dickinson and Company, EE. UU.). Cada experimento tuvo siete días de muestreo (día 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21) en los que se analizaron los cambios morfológicos de dos animales. Se prestó atención al color de la cutícula, acumulación de gases y desarticulaciones. Luego, los especímenes se diseccionaron y examinaron con un microscopio estereoscópico (Stemi 2000; Carl Zeiss Microscopy Deutschland GmbH, Oberkochen, Alemania). El enfoque del análisis durante la disección se fijó en los cambios internos de los siguientes órganos: branquias, glándula digestiva, estómago, intestino, cordón nervioso ventral y tejido muscular (Fig. 2). La imagen del conglomerado de calcita en la Fig. 3 fue fotografiada con un microscopio con zoom estéreo (Axio Zoom. V16, Carl Zeiss Microscopy Deutschland, Oberkochen, Alemania). Las figuras finales se crearon utilizando Adobe Photoshop CS5 (Adobe, Dublín, República de Irlanda) con 300 ppp.

Abundancia dependiente del tiempo de géneros dominantes y descomposición óptica de áreas corporales y órganos internos de cangrejos de río en descomposición durante 21 días a 24 °C.

Precipitación de calcita dentro de cangrejos de río en descomposición. (a) Valor mediano del incremento en el volumen total de calcita de Exp. 1–4 durante 21 días a una temperatura constante de 24 °C, incluido un modelo 3D translúcido de un individuo que muestra modelos 3D reconstruidos de grupos de calcita en el lado interno de la cutícula (estructuras amarillas). (b) Espectros Raman representativos de grupos de cristales observados comparados con espectros Raman de referencia de apatito, aragonito y calcita cristalinos, tomados de la base de datos RRUFF Raman (#R060070, 0R060070, *R04017042). Los espectros Raman de los grupos de cristales exhiben bandas Raman principales típicamente para calcita cristalizada y el β-caroteno, astaxantina. ( c ) Imagen óptica de un grupo de calcita semicircular con tres setas mineralizadas (flechas rosas). ( d ) Imagen SEM del grupo de calcita que se muestra en ( c ).

Se utilizaron otros tres especímenes de cangrejos de río para la extracción de ADN a fin de analizar los cambios microbiológicos. Para monitorear los cambios en el microbioma y el agua y sedimento circundante en ausencia de cangrejos de río, se implementaron muestras en blanco sin tejido los días 1, 7, 14 y 21 y todas las pruebas se realizaron por triplicado como controles. Al comienzo de cada experimento, las canales estaban completamente articuladas y de color azul. Además, no se encontraron organismos simbióticos, parásitos o comensales en los cadáveres.

Antes de la extracción de ADN, las muestras de agua se filtraron con filtros PORAFIL® NC (d = 0,25 µm; Macherey–Nagel GmbH & Co. KG, GER). A continuación, los filtros se cortaron en trozos pequeños y se transfirieron a tubos de lisis ZR BashingBead™ (0,1 y 0,5 mm) con 750 µl de solución de lisis ZymoBIOMICS. El batido de perlas de filtros y muestras de tejido se realizó con un homogeneizador Precellys® (Bertin Technologies SAS, Montigny Le Bretonneux, FR), 6000 × g durante 30 s. El ADN se extrajo con el ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep Kit (Zymo Research, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN se eluyó en 50 µL de agua libre de ADNasa/RNasa y la concentración de ADN en ng por µL se determinó mediante un espectrofotómetro NanoDrop™ OneC Microvolume-UV/VIS (Thermo Fisher Scientific Inc., EE. UU.).

Para la secuenciación del gen 16S rRNA, la región variable V4 de la secuencia del gen 16S rRNA se amplificó con los cebadores 16S específicos de 16s-515F (GTG CCA GCM GCC GCG GTA A) y 16s-806R (GGA CTA CVS GGG TAT CTA AT)43 . La reacción de PCR se realizó como una PCR de un solo paso con el HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, EE. UU.) e incluyó una desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min, seguida de 30–35 ciclos de 95 °C durante 30 s. 53 °C por 40 s y 72 °C por 1 min, con un paso final de elongación a 72 °C por 10 min. La secuenciación de extremos emparejados (bTEFAP®) fue realizada por Molecular Research DNA (http://www.mrdnalab.com, Shallowater, EE. UU.) en un MiSeq siguiendo las pautas del fabricante44. Los datos de secuencia sin procesar se procesaron a través del QIIME245 con parámetros predeterminados, a menos que se indique lo contrario. La canalización DADA2 se utilizó para el control de calidad de la secuencia, la eliminación de ruido y el filtrado quimérico46. La clasificación taxonómica de los ASV finales (variante de secuenciación de amplicones), agrupados en un 99 % de identidad, se realizó con un clasificador bayesiano ingenuo que se entrenó con la versión 138 de la base de datos SILVA, especialmente para la región 515F/806R rRNA47,48.

Cada día de muestreo, se prepararon muestras de agua y tejido para el cultivo de especies bacterianas. En resumen, se tomó una muestra de la superficie del tejido del cangrejo de río para aislar las especies que forman biopelículas. El hisopo se incubó en medio de caldo de soya triptona (TSB) más glucosa al 1 % en diez diluciones diferentes durante 3 días a 30 °C y luego se sembró en agar Columbia con sangre de carnero al 5 % (COL [BD™, Becton, Dickinson and Company, Nueva Jersey, EE. UU.]) para su posterior cultivo. Además, 50 µL de las muestras de agua se sembraron en placas de agar selectivo (p. ej., R-2A [Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.], agar MacConkey [BD™, Becton, Dickinson and Company, Nueva Jersey, EE. UU.], medio LB mínimo [2,5 g/l de triptona, 2,5 g/l de NaCl, 1,25 g/l de extracto de levadura, 18 g/l de agar, pH 7,5]) e incubado hasta 1 semana a 30 °C. Se realizó un aislamiento adicional en agar COL. Los cultivos puros se identificaron mediante espectroscopía de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz (Microflex® LT MALDI-TOF/MS Bruker Corporation, Billerica, EE. UU.) o secuenciación del gen 16S rRNA. La secuenciación fue realizada por GATC Biotech AG (GER) y las secuencias se compararon con la base de datos EZBioCloud49.

El análisis de las métricas de diversidad alfa se realizó con el paquete R "vegan" (versión 2.5.650). Las visualizaciones de las estadísticas y la composición de la comunidad microbiana se realizaron con el paquete R "ggplot2"51.

Durante los primeros 4 días, tres ejemplares de Exp. 1 a 4 (E1-21.1 a E1-21.3; E2-21.1 a E2-21.3; E3-21.1 a E3-21.3; E4-21.1 a E4-21.3) se escanearon inicialmente una vez al día, seguidos de escaneos después de 7, 14 y 21 días utilizando un escáner de microtomografía computarizada (µ-CT) phoenix|x-ray v|tomex s 240 (GE Measurement & Control, GER) ubicado en el Instituto de Geociencias de la Universidad de Bonn. Cada conjunto de datos tiene una resolución de 38 µm; las exploraciones se realizaron a 80 kV y 100 µA. Se adquirieron tres fotogramas por proyección en un tiempo de 500 ms para un total de 1000 proyecciones. Los datos de µ-CT se procesaron con el software VG Studio Max 3.2 (Volume Graphics, Heidelberg, Alemania [https://www.volumegraphics.com/de/produkte/vgsm/whats-new-in-vgstudio-max-3-2 -x.html]) y Avizo 8.0 (Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania [https://www.thermofisher.com/de/de/home/electron-microscopy/products/software-em-3d-vis/avizo- software.html]) para reconstruir y visualizar grupos de cristales precipitados dentro de las muestras y gastrolitos ubicados dentro del estómago. Además, se utilizó Avizo 8.0 para mediciones de volumen de modelos de superficie 3D poligonales.

Se obtuvieron grupos de cristales (si los había) de los cadáveres y se analizaron con un espectrómetro Raman confocal LabRam HR800 (Horiba Scientific) ubicado en el Instituto de Geociencias de la Universidad de Bonn. Se utilizó un láser de diodo de 100 mW y 784 nm como fuente de excitación, una rejilla de 600 ranuras/mm y un objetivo de 100 × con una apertura numérica de 0,9. El tamaño del orificio confocal y el tamaño de la rendija de entrada del espectrómetro se establecieron en 1000 y 100 µm, respectivamente. Con estos ajustes la resolución espectral fue de 4,6 cm−1. El tiempo total de exposición fue de 2 min con cuatro acumulaciones de 30 s.

Los grupos de cristales (si los había) se diseccionaron y recubrieron con una fina capa de oro con un aplicador de pulverización fría (Cressington Sputter Coater 108 manual, Tescan GmbH, Dortmund, Alemania). Posteriormente, las muestras se escanearon con una unidad de microscopio electrónico de barrido (SEM) "ambiental" (TESCAN VEGA 4 LMU) utilizando el detector SE a 20 keV. Las imágenes tienen 1536 × 1331 píxeles y 16 bits. La distancia de trabajo de cada imagen SEM se puede encontrar en los pies de figura.

En agua de lago sin tratar en condiciones aeróbicas (Exp. 1), se observó un cambio de color de las cutículas y un fuerte olor a descomposición el día 2. Se realizaron observaciones comparables en agua de lago esterilizada en condiciones aeróbicas (Exp. 2) y anaeróbicas (Exp. 4) después de 3 días y también después de 4 días en condiciones anaeróbicas en agua de lago sin tratar (Exp. 3) (Fig. 2 y Tabla complementaria 3). En el día 7, las cutículas de los cangrejos de río aparecieron blandas y gelatinosas en todos los experimentos.

En condiciones anaeróbicas (Exp. 3 y 4), independientemente del tratamiento del agua, los músculos inicialmente blancos mostraron una decoloración rosada el día 3, mientras que los mismos cambios se notaron el día 4 en experimentos que comenzaron en condiciones aeróbicas (Exp. 1 y 2).

En todos los individuos de todos los experimentos, el estómago se descompuso dentro de los primeros 4 días (Fig. 2), así como la glándula digestiva en los individuos que habían sido incubados en condiciones anaeróbicas. En condiciones aeróbicas, la glándula digestiva pudo identificarse durante al menos 1 semana. Después de este tiempo, los músculos estaban carnosos y las cutículas translúcidas y gelatinosas. El cordón nervioso ventral, el intestino y las branquias ya no eran visibles en ninguno de los animales, con la excepción de las branquias en los individuos de Exp. 2 (aeróbico, estéril) (Fig. 2), que fueron visibles hasta el día 14.

Después de 2 semanas, el sedimento y las canales de Exp. 1 a 3 estaban cubiertos por una capa negra que apareció en Exp. 4 (anaeróbico, estéril) solo después de 21 días. Además, se notó una acumulación de gas de putrefacción alrededor del área branquial en individuos de Exp. 1 (aeróbico, sin tratar), que resultó en un cefalotórax flotante desprendido del individuo E1-21.1 el día 24, 3 días después del período de estudio regular (Fig. 4a complementaria). El cefalotórax del individuo E1-21.3 se desprendió solo parcialmente del pleón y flotó, sosteniendo los restos del cuerpo colgante, también el día 24 (Fig. 4b complementaria).

No se notó acumulación de gas en ningún espécimen de los otros experimentos, pero observamos una separación del pleon del cefalotórax en individuos de Exp. 2 (aeróbico, estéril) después de 7 días y en especímenes de cangrejos de río de Exp. 3 (anaeróbico, sin tratamiento) después de 2 semanas.

Para analizar la sucesión temporal de la composición de la comunidad microbiana (MCC) en los cuatro experimentos, realizamos la secuenciación de amplicón de ARNr 16S en siete puntos de tiempo con tres réplicas biológicas independientes. La sucesión bacteriana dentro de los triplicados fue comparable y permitió una interpretación de distintas tendencias. El MCC del sedimento se mantuvo estable a lo largo de las estaciones (Tabla complementaria 4). La diversidad α, calculada a través del índice de Shannon52, disminuyó en todas las condiciones durante los primeros 3 días. En los experimentos de control (Exp. 2: aeróbico, estéril; Exp. 4: anaeróbico, estéril), la diversidad se mantuvo estable alrededor de un índice de Shannon de ~ 1.5, mientras que en los experimentos con el agua del lago natural se pudo detectar un ligero aumento hasta el final de los experimentos (cf, Tabla complementaria 5; Figura complementaria 5). En todos los experimentos, las muestras de los días iniciales se caracterizaron por altas cantidades de Proteobacteria, pero después de 4 días, los filos Firmicutes y Bacteroidetes se volvieron dominantes (cf, Tabla complementaria 6). Después de que se hubo consumido el oxígeno residual, las bacterias anaerobias obligadas se hicieron cargo de todas las muestras. El MCC en los experimentos realizados con agua de lago sin tratar y sedimento (Exp. 1 y Exp. 3) estuvo dominado primero por Aeromonas sp. Estas bacterias ya estaban presentes en los animales el día 1 (Tabla complementaria 7). Las aeromonas fueron superadas por Clostridium sp. durante la parte media del experimento. Después de que el estómago y la glándula digestiva de los cangrejos de río colapsaran, aumentaron las especies del género Acetobacteroides. Bajas abundancias de Proteocatella sp. fueron encontrados en Exp. 1 (aeróbico, sin tratar) y Exp. 3 (anaeróbico, sin tratar), mientras que este género estuvo ausente en los controles estériles (Exp. 2 y Exp. 4). Aquí, los MCC diferían entre sí. Exp. 4 (anaeróbico, estéril) mostró una progresión bacteriana comparable a Exp. 1 y exp. 3 (ambos sin tratar), aunque Aeromonas sp. mostró un florecimiento bifásico en ambos experimentos de control (Exp. 2 y Exp. 4), es decir, una disminución temporal que fue acompañada por un aumento de Clostridium sp. durante unos pocos días. El decaimiento inicial en Exp. 4 (anaeróbico, estéril) mostró la presencia de Candidatus Bacilloplasma sp. y Bacillus sp., mientras que los animales en descomposición de Exp. 2 (aeróbico, estéril) fueron colonizados por bacterias formadoras de esporas del género Sporobacter (grupo Ruminococcaceae NK4A214) y Ruminiclostridium en las muestras finales (Fig. 2 y Tabla complementaria 8 para MMC de todos los géneros). Las cepas bacterianas aisladas y sus propiedades se muestran en la Tabla complementaria 9.

Las imágenes de µ-CT revelaron la precipitación de grupos de cristales en todas las configuraciones experimentales, comenzando en los quelípedos del espécimen individual E2-21.2 en Exp. 2 ya después de 2 días o después de 3 días en las muestras E2-21.3, E3-21.2 y E4-21.3. Después de 4 días, los grupos de cristales habían precipitado en todos los individuos (Tabla complementaria 10a). A medida que avanzaba la descomposición, se observaron estructuras cristalinas en el lado ventral del cefalotórax, dentro de los pereiópodos, dentro de la coxa de los pleópodos, a lo largo del lado ventrolateral de los tergitos, en el telson y en los urópodos. Además, las imágenes de µ-CT revelaron que estos grupos de cristales solo precipitaron en el lado interno de las cutículas. Todos los especímenes escaneados de Exp. 1 (aeróbico, sin tratar) y Exp. 2 (aeróbico, estéril) contenía un par de gastrolitos. Las mediciones de volumen de modelos de superficie 3D poligonales de grupos de cristales y gastrolitos mostraron un aumento del volumen de los grupos de cristales y, al mismo tiempo, una reducción del volumen de los gastrolitos con descomposición progresiva (Tabla complementaria 10b). Es importante destacar que, en los experimentos que se realizaron en condiciones estériles (Exp. 2 y Exp. 4), se observó un volumen total más pequeño de agrupaciones de cristales en comparación con los experimentos realizados con agua y sedimento sin tratar (Exp. 1 y Exp. 3). Además, el volumen total de racimos de cristales en Exp. 4 (anaeróbico, estéril) disminuyó antes del final del experimento (Fig. 3a).

Los análisis Raman revelaron claramente que los grupos de cristales consistían en cristales de calcita bien ordenados (Fig. 3b), que pueden identificarse por la banda vibratoria de estiramiento v1(CO3) totalmente simétrica cerca de 1085 cm−1, así como por la presencia de bandas cerca de 154 y 281 cm−1 que se asignan a las vibraciones de la red de calcita, estando este último ausente en el carbonato de calcio amorfo (ACC). Además, algunos análisis Raman de los grupos de cristales mostraron un espectro mixto con bandas fundamentales de calcita cristalina y β-caroteno, astaxantina (AXT) (Fig. 3b) que se identificó por los modos típicos de alta intensidad cerca de 1157 y 1517 cm- 1 que se asignan a las vibraciones de estiramiento C=C y C–C de los enlaces de la cadena de polieno, respectivamente53,53,55. En comparación con el espectro obtenido del estándar AXT, se observó una pequeña pero clara desviación en la frecuencia de la banda de ~ 1517 cm−1, lo que presumiblemente puede estar relacionado con las diferencias estructurales en el AXT.

Las imágenes SEM mostraron varias estructuras de grupos de calcita precipitados (Fig. 6a-f complementaria) que varían en tamaño de 100 a 900 µm al final del experimento. Se encontró una estructura de calcita dentro de un pereiópodo del individuo E1-21.3 con restos de cutícula mineralizada y tres setas plumosas (Fig. 3c,d). La mayoría de los grupos de calcita eran esféricos (Fig. 6d complementaria) o biesféricos. Algunos grupos de cristales eran más o menos elípticos con uno o dos engrosamientos redondeados en un extremo (Figura complementaria 6c, e, f). Todas las estructuras de calcita mostraron decoloraciones rojizas y se descubrieron en el lado interno de las cutículas (Fig. 3c y Fig. 6a complementaria).

Esta es la primera investigación detallada de la sucesión bacteriana en la descomposición de tejidos blandos y la conservación de artrópodos en agua dulce. Los análisis microbianos durante la descomposición del cangrejo de río C. diminutus bajo diferentes parámetros predefinidos mostraron sucesiones comunitarias reproducibles en todos los experimentos. Las bacterias anaerobias facultativas que dominaban los tejidos al comienzo de nuestros experimentos y que son capaces de crecer tanto en presencia como en ausencia de oxígeno, fueron superadas rápidamente por los organismos anaerobios obligados. También se han descrito cambios similares en la ciencia forense para la descomposición terrestre de ratones, cerdos y humanos56,56,57,59. Después de 7 días, la flora bacteriana a menudo cambia debido a una disminución de nutrientes y la necesidad de vías metabólicas alternativas para generar energía60, lo que también se detectó en Exp. 1 (aeróbico, sin tratar), Exp. 3 (anaeróbico, sin tratar) y Exp. 4 (anaeróbico, estéril). Inicialmente, los cadáveres en descomposición estaban habitados por el filo Proteobacteria, mientras que más tarde se detectaron principalmente Firmicutes y Bacteroidetes (consulte la Tabla complementaria 6) 58,61,62. El microbioma del cangrejo de río en descomposición comprendía tres géneros dominantes, Aeromonas, Clostridium y Acetobacteroides. En todos los experimentos, el género Aeromonas colonizó los cadáveres durante la fase inicial y alcanzó los recuentos máximos en los días 2 y 3. Estas bacterias acuáticas anaerobias facultativas se encuentran de forma ubicua63 y desempeñan un papel importante en la descomposición de los cadáveres en agua dulce y salobre64,65. También son patógenos, causando infecciones en peces y otros animales, así como en humanos inmunocomprometidos66. Las especies patógenas A. hydrophila, A. salmonicida y A. veronii se aislaron de los experimentos y confirman el papel prominente de Aeromonas en la descomposición de los organismos acuáticos, como lo demostró Lobb62 para los peces. Muchos de los aislamientos eran formadores de biopelículas. Dominación de Aeromonas sp. en el proceso de descomposición inicial puede explicarse por la secreción de diversas exoenzimas, como hemolisinas, proteasas, quitinasas o lipasas específicas que contribuyen a la lisis de la célula huésped62,67,67,68,69,71.

Después de 2 o 3 días, la cantidad de Clostridium aumentó en todos los experimentos concomitantemente con una disminución de Aeromonas y alcanzó su máximo en el día 7. Los Clostridium están asociados con infecciones anaerobias y descomposición de tejidos humanos y animales30,58,61,62,72 y se encuentran comúnmente en el tracto gastrointestinal de varios organismos y en el suelo73,74. Dado que también estaban presentes en los controles estériles y rara vez se podían detectar en el sedimento (consulte la Tabla complementaria 4), deben derivar del tracto gastrointestinal de los cangrejos de río o las esporas que estaban presentes en la superficie del cuerpo. Este género también se detecta con frecuencia en experimentos forenses56,58,60,61. Algunas especies de este género pueden escindir el colágeno y el ácido hialurónico y producir toxinas que destruyen las membranas celulares, lo que resulta en la liberación de nutrientes frescos de los cadáveres75,75,76,78. Por lo tanto, la falta de nutrientes puede haber contribuido a la disminución de las aeromonas que habían estado colonizando el cadáver en primer lugar. Anoxia tampoco era parte de la configuración experimental en Exp. 3 y exp. 4 o desarrollado a través de la actividad microbiana en Exp. 1 y exp. 214. Posteriormente, en todos los experimentos Aeromonas sp. y Clostridium sp. fueron superados por Rikenellaceae (Acetobacteroides sp.) después del día 7, excepto en Exp. 2 (aeróbico, estéril) en el que este género estuvo ausente y se observó un aumento secundario de aeromonas. Acetobacteroides spp. son estrictamente anaeróbicos y fermentan azúcares poliméricos (glucógeno), hexosas, pentosas y triptona en acetato, CO2 y H279. El aumento de este género ocurrió simultáneamente con el colapso del estómago y la glándula digestiva, que es un órgano de almacenamiento de glucógeno en los crustáceos80, lo que indica que la liberación de sustratos por la descomposición de estos órganos ricos en nutrientes podría haber favorecido la proliferación de Acetobacteroides sp. o que este género es un habitante natural de estas partes del cuerpo. El intestino del camarón oriental de río Macrobrachium nipponense, que es una especie del orden Decapoda como C. diminutus, alberga miembros de Acetobacteroides81. Se observa que también los controles de tejido en el día 1 exhibieron especies relacionadas (consulte la Tabla complementaria 7) y, por lo tanto, la ausencia de Acetobacteroides en Exp. 2 es sorprendente.

La precipitación de minerales suele ser un paso importante en la conservación de organismos de cuerpo blando82. En todos los experimentos, la precipitación de cristales de calcita se detectó en el lado interno de los caparazones de los cangrejos de río, aunque en diferente medida. En Exp. 1 y 3 (sin tratar) precipitó un mayor volumen de calcita, independientemente del contenido de oxígeno, que en Exp. 2 y 4 (estéril) (Fig. 3a). El volumen total de calcita (TVC) en Exp. 4 incluso disminuyó el día 7, lo que puede explicarse por una acidificación del pH a través de la actividad microbiana dentro de los especímenes83. Se encontró que el pH depende del sustrato que se degrada y puede cambiar según las vías metabólicas activas en la muestra y, a su vez, influir en el ambiente químico local y la precipitación mineral en experimentos tafonómicos39,84,85. Para los cangrejos de río se observó que la precipitación de calcita depende del tamaño corporal y/o el estado de la fase de muda actual83. Al comienzo de cada fase de muda, los iones de calcio de la cutícula se disuelven fuera de las capas de la cutícula y se transportan a través del sistema circulatorio hemolinfático dentro de la pared del estómago cardíaco y se forman nódulos de almacenamiento de calcio llamados "gastrolitos", que consisten en una red de fibras de proteína-quitina y carbonato de calcio amorfo (ACC)86,87. Por lo tanto, estos iones de calcio solo están disponibles de forma limitada para la precipitación de calcita después de la muerte83. Sin embargo, dado que los individuos comparados rara vez diferían en el tamaño corporal (consulte la Tabla complementaria 2a, b) y las etapas de muda (Tabla complementaria 10b), estos factores no pueden explicar las diferencias significativas en la precipitación de calcita.

Los resultados de la secuenciación del microbioma revelaron la presencia del género Proteocatella en las muestras de Exp. 1 y exp. 3 en agua de lago sin tratar, mientras que estuvo ausente en Exp. 2 y exp. 4 (controles estériles). Hasta ahora, solo se ha cultivado la especie tipo, Proteocatella sphenisci. Se aisló de las excreciones del pingüino de Magallanes (Spheniscus magellanicus88) que se alimenta de peces y crustáceos. Se han descrito miembros no cultivados del género Proteocatella a partir de aguas residuales, ríos y agua potable y microbiota intestinal89,89,91. Sin embargo, el género también forma parte del microbioma de los trombolitos carbonizados que se encuentran en la Laguna Larga de agua dulce subpolar poco profunda en el sur de Chile92. Otro dato interesante es que Proteocatella spp. es conocido como un componente de la placa dental felina93 y canina94,95 que puede mineralizarse y convertirse en cálculo dental96. Por lo tanto, las especies del género Proteocatella podrían haber sustentado la precipitación de calcita en los cadáveres de cangrejos de río de Exp. 1 y exp. 3 y podría ser uno de los géneros responsables de la fosilización. Oscilibacter sp. y Desulfovibrio sp. también estuvieron presentes solo en los experimentos con agua no esterilizada, aunque en cantidades bajas. Ambos géneros se han asociado con mineralización97,97,99 o formación de placas100.

Se ha asumido ampliamente que las condiciones anaeróbicas y especialmente reductoras ralentizan la degradación de los tejidos blandos29,30,31,32,33,34,35, ya que inhiben las enzimas autolíticas que son responsables de los procesos iniciales de descomposición y excluyen a los carroñeros externos y, por lo tanto, bioturbación31,38,101. Sin embargo, en nuestros experimentos, el tejido del cangrejo de río se degradó de manera comparable tanto en condiciones iniciales anaeróbicas como aeróbicas. Lo más probable es que esto se deba al establecimiento de condiciones anaeróbicas en todos los montajes experimentales en poco tiempo, ya que la aireación artificial mediante incubación en un agitador orbital habría destruido los cadáveres y, por lo tanto, no sería posible9,14,26,85. Otra explicación para los patrones de descomposición comparables podría ser una inhibición insuficiente de la actividad autolítica en los experimentos. En presencia de oxígeno, el estómago se descompuso a los 2 días (Exp. 1, Exp. 2), mientras que en condiciones anaerobias este órgano permaneció intacto hasta el día 3 (Exp. 3, Exp. 4), a diferencia de la glándula digestiva, que decayó posteriormente en un entorno óxico. Antes de la descomposición, los músculos mostraban un cambio de color de blanco a rosa que se detectó antes en condiciones anaeróbicas que en condiciones aeróbicas, muy probablemente causado por la liberación y difusión de astaxantina (AXT), un pigmento normalmente ligado al complejo proteico α-crustacianina en el caparazón de crustáceos vivos102. De hecho, también se ha observado la difusión de astaxantina en cúmulos de calcita, que habían precipitado en el lado interno de la cutícula (Fig. 3b,c).

Otros experimentos también podrían detectar no16,38,39,40 o rara vez una diferencia en la tasa de descomposición bajo diversas condiciones de oxígeno. Hancy y Antcliffe41 incluso demostraron que algunas estructuras tisulares se conservan mejor en presencia de oxígeno. En experimentos previos, las condiciones reductoras se establecieron mediante la incubación de pequeños organismos con β-mercaptoetanol34,35,103. Nuestros resultados indican que la concentración del agente reductor debe adaptarse al tamaño corporal de los organismos, ya que los protocolos anteriores no podían garantizar una inhibición eficaz de los procesos autolíticos.

El microbioma de los organismos es individual y, por tanto, puede influir en la degradación y conservación de forma diferente35,104 y, por tanto, permite asumir un potencial de conservación individual en la naturaleza. Sin embargo, en estos experimentos, todos los animales procedían del mismo tanque y las réplicas biológicas mostraban las mismas tendencias en la sucesión microbiana y la destrucción de tejidos. El análisis del origen de la degradación o conservación de los organismos fue complejo y la mayoría de las bacterias dominantes se podían encontrar en el tejido, así como en el agua y los sedimentos. Además, el análisis de la composición de la comunidad microbiana y su influencia en la descomposición y conservación de los tejidos blandos se ve obstaculizado por bacterias que muestran un comportamiento variable en diferentes composiciones ambientales, como el descomponedor marino P. tunicata31. Para obtener más información sobre el comportamiento de las bacterias y sus rutas metabólicas activas, se debe realizar un análisis transcriptómico.

En conclusión, se observó una sucesión de descomponedores fijos de Aeromonas, Clostridium y Acetobacteroides que reproducían fielmente el "necrobioma" descrito para peces de agua dulce62 bajo diferentes condiciones experimentales para Cambarellus diminutus. La presencia de estas bacterias estuvo acompañada de la formación de calcita cristalina dentro de los animales y fue especialmente pronunciada en presencia del género Proteocatella.

Todos los datos de secuencia sin procesar relacionados con este estudio se depositan en la base de datos del Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) (Instituto Europeo de Bioinformática, EMBL-EBI), un socio colaborador de la Base de datos internacional de secuencias de nucleótidos (INSDC), [Número de acceso al estudio: PRJEB51206]. https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB6609.

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Descargar referencias

Agradecemos a JA Schultz y R. Schellhorn por sus fructíferos debates y agradecemos a T. Martin por proporcionarnos el dispositivo µ-CT (toda la Sección Paleontología, Instituto de Geociencias). Agradecemos a O. Dülfer, P. Göddertz, G. Oleschinski por su apoyo (toda la Sección Paleontología, Instituto de Geociencias). J. Rust y G. Bierbaum están financiados por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación)—Projekt-Nummer 386704301 como parte de la unidad de investigación de la DFG FOR2685 "Los límites del registro fósil: enfoques analíticos y experimentales de la fosilización (Projektnummer 348043586)." Esta es la contribución número 50 de la unidad de investigación DFG FOR2685.

Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Estos autores contribuyeron por igual: Bastian Mähler y Kathrin Janssen.

Sección Paleontología, Instituto de Geociencias, Rheinische Friedrich-Wilhelms Universität Bonn, 53115, Bonn, Alemania

Bastian Mahler y Jes Rust

Instituto de Microbiología Médica, Inmunología y Parasitología, Facultad de Medicina, Rheinische Friedrich-Wilhelms Universität Bonn, 53127, Bonn, Alemania

Kathrin Janssen y Gabriele Bierbaum

Sección de Geoquímica, Instituto de Geociencias, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn, 53115, Bonn, Alemania

Mara Iris Lönartz, Markus Lagos y Thorsten Geisler

Instituto de Investigación sobre Energía y Clima (IEK-6): Gestión de Residuos Nucleares, Forschungszentrum Jülich GmbH, 52428, Jülich, Alemania

Mara Iris Lönartz

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BM y KJ contribuyeron igualmente a este trabajo. Conceptualización: JR, BM, GB Adquisición de fondos: GB, JR Investigación: KJ, BM, MIL, ML Conservación de datos: KJ, BM, TG Redacción del borrador original: KJ, BM Revisión y edición: KJ, BM, MIL, ML, TG, GB

Correspondencia a Bastian Mähler o Kathrin Janssen.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Mähler, B., Janssen, K., Lönartz, MI et al. Cambios microbianos dependientes del tiempo durante la descomposición del cangrejo de río en agua dulce y sedimentos bajo diferentes condiciones ambientales. Informe científico 13, 1539 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28713-x

Descargar cita

Recibido: 24 julio 2022

Aceptado: 23 de enero de 2023

Publicado: 27 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28713-x

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