Competencia entre especies en biopelículas orales mediada por Streptococcus gordonii desoxirribonucleasa extracelular SsnA

npj Biofilms and Microbiomes volumen 8, Número de artículo: 96 (2022) Citar este artículo

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El ADN extracelular (eDNA) es un componente clave de muchas biopelículas microbianas, incluida la placa dental. Sin embargo, las funciones de las enzimas desoxirribonucleasas extracelulares (DNasa) dentro de las biopelículas son poco conocidas. Streptococcus gordonii es un colonizador pionero de la placa dental. Aquí, identificamos y caracterizamos SsnA, una proteína asociada a la pared celular responsable de la actividad de la ADNasa extracelular de S. gordonii. La actividad de ADNasa extracelular mediada por SsnA de S. gordonii se suprimió después del crecimiento en azúcares. SsnA se purificó como proteína recombinante y se demostró que era inactiva por debajo de pH 6,5. SsnA inhibió la formación de biopelículas por Streptococcus mutans de una manera dependiente del pH. Además, SsnA inhibió el crecimiento de biopelículas de microcosmos orales en la saliva humana. Sin embargo, la inhibición mejoró con la adición de sacarosa. Juntos, estos datos indican que SsnA de S. gordonii juega un papel clave en la competencia entre especies dentro de las biopelículas orales. La acidificación del medio a través del catabolismo del azúcar podría ser una estrategia para especies cariogénicas como S. mutans para evitar la exclusión de biopelículas mediada por SsnA.

La cavidad bucal suele albergar entre aproximadamente 100 y 300 taxones bacterianos diferentes que colonizan las superficies de los tejidos duros y blandos1. La composición taxonómica y la distribución de las bacterias dentro de las biopelículas orales están determinadas por procesos de adherencia selectiva, interacciones competitivas y mutualistas entre las especies y el entorno proporcionado por el huésped2,3,4,5. La acumulación de placa dental, el biofilm formado en la superficie de los dientes, ocurre de manera ordenada espaciotemporalmente6. Los colonizadores pioneros capaces de adherirse a la película de esmalte adquirida sientan las bases de la placa dental y proporcionan receptores para el reclutamiento de colonizadores secundarios, lo que eventualmente conduce al desarrollo de comunidades microbianas complejas y dinámicas7,8. Los colonizadores pioneros generalmente se consideran comensales o incluso beneficiosos para mantener la salud bucal2,9,10. Sin embargo, si la placa dental no se controla adecuadamente, se puede desarrollar caries dental o periodontitis11. Estas dos condiciones son responsables de la gran mayoría de las pérdidas de dientes en todo el mundo12. La enfermedad se asocia con cambios en la composición y actividades bioquímicas de la placa dental que resultan en un estado de disbiosis13,14. En el caso de la caries dental, el exceso de frecuencia y/o cantidad de ingesta de azúcares en la dieta selecciona biopelículas disbióticas enriquecidas en bacterias acidúricas y acidogénicas que reducen el pH en la superficie del diente y provocan la desmineralización del esmalte dental o el cemento. Una mayor progresión de la lesión da como resultado la destrucción de la dentina y la invasión de bacterias en la cámara pulpar15,16.

Los colonizadores pioneros, como los estreptococos del grupo Mitis, juegan un papel importante en el control del crecimiento excesivo de bacterias más acidogénicas y cariogénicas, como Streptococcus mutans. Por ejemplo, Streptococcus gordonii expresa un sistema de arginina desaminasa (AD) que contrarresta la acidificación de la biopelícula generando amoníaco y dióxido de carbono mientras produce energía para las células9,17,18,19,20. En presencia de oxígeno, S. gordonii y otros miembros del grupo Mitis de estreptococos, incluido Streptococcus sanguinis, producen cantidades sustanciales (milimolares) de peróxido de hidrógeno (H2O2), que pueden inhibir el crecimiento de S. mutans21. Además, es posible que los colonizadores pioneros compitan con S. mutans por los sitios de unión dentro de la biopelícula. La unión de S. mutans depende en gran medida de la presencia de sacarosa, que se metaboliza extracelularmente para producir glucanos que respaldan la adhesión y la colonización de biopelículas22. En ausencia de sacarosa, la adhesión de S. mutans parece estar mediada por el ADN extracelular (eDNA)23. El ADN extracelular también es importante para la integridad estructural de las biopelículas maduras de S. mutans, ya que el tratamiento con ADNasa I da como resultado la dispersión de la biopelícula24,25. Recientemente se ha demostrado que el eDNA está presente en biopelículas más complejas, incluida la placa dental de especies mixtas26,27,28,29,30,31. El tratamiento de la placa dental, particularmente en las primeras etapas de desarrollo, con enzimas DNasa exógenas reduce significativamente la biomasa del biofilm y agota selectivamente ciertas especies que parecen ser particularmente dependientes del eDNA27,31,32. Además, el eDNA sirve como fuente de nutrientes y reservorio para la transferencia horizontal de genes dentro de la placa dental3,16.

Muchas bacterias producen enzimas desoxirribonucleasa (DNasa) unidas a la superficie o secretadas33,34. En las biopelículas, las ADNas extracelulares cumplen una variedad de funciones, incluida la diseminación de células bacterianas, la renovación del ADN electrónico y la transferencia horizontal de genes8,35,36,37,38. En los patógenos, las enzimas DNasa extracelulares suelen estar relacionadas con la virulencia y la evasión de las respuestas inmunitarias del huésped, como las trampas extracelulares de neutrófilos (NET)39,40. Varias bacterias orales, incluida S. gordonii, producen enzimas DNasa extracelulares33,34,41. Sin embargo, sus funciones en el mantenimiento de biopelículas y las interacciones entre especies son poco conocidas. Aquí, identificamos y caracterizamos la enzima responsable de la actividad de la ADNasa extracelular de S. gordonii. Además, investigamos el efecto de esta enzima en el desarrollo de biopelículas de S. mutans o biopelículas de especies mixtas más complejas formadas por bacterias orales humanas.

Para determinar la extensión de eDNA dentro de la matriz de biopelículas de S. gordonii DL1 y S. mutans GS-5, se extrajo eDNA de biopelículas monoespecies cultivadas estáticamente durante 48 h. Se observó una banda de alto peso molecular (>10 kpb) en extractos aislados de biopelículas de S. mutans pero no en biopelículas de S. gordonii (Fig. 1a). El tamaño del fragmento era similar al ADN cromosómico intracelular (iDNA) extraído de células de S. mutans. Esta banda no se observó después del tratamiento enzimático de los extractos con ADNasa I (Fig. 1 complementaria). El análisis de espectrofotometría NanoDrop de los extractos mostró que el eDNA representaba aproximadamente el 19 % del ADN total (iDNA + eDNA) en las biopelículas de S. mutans, mientras que representaba solo el 6 % del ADN total en las biopelículas de S. gordonii. El papel del eDNA en el mantenimiento de la integridad de las biopelículas de S. mutans y S. gordonii se investigó mediante el tratamiento de biopelículas de S. mutans y S. gordonii preformadas con 5 µg/mL de DNasa I durante 1 h a 37 °C (Fig. 1b , C). La tinción con cristal violeta reveló que el tratamiento con ADNasa I redujo significativamente la biomasa del biofilm de S. mutans en >90 %. Por el contrario, las biopelículas de S. gordonii no se vieron afectadas por el tratamiento con ADNasa I. La inclusión de DNasa I durante el desarrollo de biopelículas inhibió significativamente la acumulación de biopelículas de S. mutans pero no afectó a S. gordonii (Fig. 1d).

a Electroforesis en gel de agarosa de ADN intracelular y extracelular (iDNA y eDNA) aislado de biopelículas de S. gordonii y S. mutans. Las biopelículas se cultivaron durante 48 h en placas de múltiples pocillos y las células se separaron de la matriz extracelular mediante centrifugación antes de la extracción de ADN. La flecha negra indica eDNA. El marcador (M) se corrió en el mismo gel que las muestras de S. gordonii pero separado de los carriles de muestra. Las muestras de S. mutans se analizaron en un gel diferente. b Se trataron biopelículas preestablecidas de S. gordonii y S. mutans cultivadas durante 20 h en medio BHY con 5 μg/mL de DNasa I durante 1 h a 37 °C. Las biopelículas se tiñeron con cristal violeta y la biomasa se cuantificó disolviendo el colorante y midiendo la absorbancia a 570 nm. c Cuantificación de biopelículas de S. gordonii DL1 y S. mutans GS-5 teñidas con cristal violeta cultivadas en presencia y ausencia de 5 μg/ml de ADNasa I. gordonii se inhibieron cuando se cultivaron en presencia de 5 μg/ml de ADNasa I. d La cuantificación de biopelículas de S. mutans preformadas tratadas con 5 μg/ml de DNasa I durante 1 hora a 37 °C mostró una reducción significativa con el tratamiento con DNasa I ( dispersión), mientras que las biopelículas de S. gordonii no se redujeron. Los puntos de datos se muestran para 4–6 experimentos independientes, las barras representan la media y se indica SD. La distribución de los datos pasó la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk y, por lo tanto, se calculó la significación estadística mediante la prueba t de Student; ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Presumimos que los bajos niveles de eDNA en las biopelículas de S. gordonii pueden deberse a la producción de una enzima DNasa extracelular. El cribado del genoma DL1 de S. gordonii mediante NCBI Blast identificó tres genes que potencialmente codificaban proteínas con dominios de tipo DNasa I. De estos, los genes que codifican una enzima exonucleasa III y una proteína RgfB marcada no tenían características de proteínas secretadas. El tercer gen (SGO_RS08090; GenBank Accession WP_012130709.1) codificó una proteína putativa de 779 aminoácidos con una señal de secreción N-terminal y un motivo LPxTG C-terminal para el anclaje a la pared celular mediado por sortasa, indicativo de una pared celular extracelular. enzima unida (Fig. 2a). En vista de la homología con otras nucleasas extracelulares estreptocócicas, incluida la SsnA de Streptococcus suis42, el gen putativo de la ADNasa de S. gordonii se denominó ssnA (Streptococcal Surface Nuclease A). Para probar si el gen ssnA era responsable de la actividad de la ADNasa extracelular en S. gordonii, se eliminó el ssnA y se evaluó la actividad de la ADNasa extracelular utilizando agar de prueba de ADNasa (Fig. 2b). Era visible una zona de eliminación alrededor de las colonias de S. gordonii de tipo salvaje, lo que indica que estas células producían ADNasa extracelular. Por el contrario, no se detectó actividad de ADNasa extracelular en el mutante ∆ssnA. La complementación genética del gen ssnA bajo su promotor nativo (S. gordonii ssnAComp) restableció la actividad DNasa (Fig. 2b).

a Diagrama esquemático de la organización del dominio de la proteína codificada por el gen ssnA. Las posiciones de los dominios predichos que incluyen un péptido señal putativo (SP), un pliegue OB, un dominio de nucleasa y un motivo de anclaje de la pared celular LPxTG están marcadas con números de residuos de aminoácidos iniciales y finales desde el extremo N-terminal. b La actividad de DNasa extracelular se evaluó usando agar de prueba de DNasa. Un halo claro alrededor de las colonias de S. gordonii DL1 silvestre indica actividad de ADNasa. No había halo visible en S. gordonii ΔssnA, mientras que la actividad de DNasa extracelular se restauró en S. gordonii ssnAComp. c La fracción celular y el medio de cultivo gastado se separaron mediante centrifugación de cultivos planctónicos de S. gordonii de tipo salvaje, las cepas mutante ΔssnA y ssnAComp, y la actividad nucleasa de cada fracción se determinó mediante un ensayo cuantitativo basado en fluorescencia. S. aureus FH7 se incluyó como control. La actividad de ADNasa extracelular de S. gordonii se asoció principalmente con las células, mientras que la actividad de ADNasa de S. aureus fue mayor en medio acondicionado. En el análisis se usaron volúmenes idénticos de fracciones celulares y sobrenadantes. Los puntos de datos se muestran para 3 repeticiones independientes, las barras representan la media y se indica SD.

Para explorar más a fondo la producción de SsnA en S. gordonii, se empleó un ensayo cuantitativo de actividad de ADNasa basado en fluorescencia (Fig. 2c). La actividad de ADNasa se determinó en fracciones unidas a células y sobrenadantes. Staphylococcus aureus FH7, que se sabe que libera ADNasa en el medio extracelular, se incluyó como control. En S. gordonii de tipo salvaje, la actividad de ADNasa fue aproximadamente 5 veces mayor en la fracción asociada a células que en el medio gastado, lo que indica que la mayoría de SsnA secretada permanece unida a la pared celular. La actividad de la ADNasa fue casi indetectable en la fracción celular y en el medio gastado de S. gordonii ΔssnA. La actividad de la ADNasa extracelular se restauró en la cepa complementada y se asoció principalmente con la fracción celular.

Inicialmente, la expresión y actividad de SsnA se monitoreó a través del crecimiento de S. gordonii en BHY (Fig. 3a). No se detectaron diferencias significativas en la actividad de SsnA asociada a células entre 2 h y 25 h (Fig. 3b). La expresión génica de ssnA en relación con la expresión del gen 16 S rRNA también fue estable durante la fase de crecimiento exponencial. Sin embargo, la expresión disminuyó durante la fase estacionaria y se redujo significativamente en más de 30 veces después de 25 h (Fig. 3c).

a Curva de crecimiento de S. gordonii cultivada aeróbicamente en BHY a 37 °C. b Se muestra la actividad de la ADNasa de las células medida a las 2, 4, 6 y 25 h usando el ensayo fluorescente cuantitativo. Se usaron medidas de densidad óptica (OD600 nm) para la normalización. c El ARN se extrajo de las muestras en diferentes momentos durante el crecimiento para evaluar la expresión de ssnA mediante RT-qPCR. El cambio de veces se normalizó a la expresión del gen 16 S rRNA. El resultado de 3 experimentos independientes y SE se muestran para cada ensayo. La distribución de datos pasó la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk. Las comparaciones múltiples ordinarias de ANOVA unidireccional y de Dunnett se realizaron utilizando GraphPad Prism 9 para determinar la significación estadística; **** p < 0,0001.

El análisis de secuencia de la región promotora de ssnA reveló un sitio de unión de consenso para la proteína A del catabolito de carbono (CcpA), o posiblemente para la proteína reguladora de maltosa MalR (Fig. 2a complementaria). Para determinar si CcpA o MalR desempeñan un papel en la regulación de la expresión de SsnA, se construyeron mutantes ∆ccpA y ∆malR y se evaluó la actividad de la ADNasa extracelular en cepas cultivadas en presencia o ausencia de azúcares añadidos (Fig. 2b complementaria). En bacterias Gram-positivas como S. gordonii, la CCR está vinculada a la absorción de azúcares a través del sistema azúcar:fosfotransferasa (PTS) dependiente de fosfoenolpiruvato. La especificidad del sustrato está determinada por el componente enzimático II (EII) de la PTS. El complejo EIIMan de S. gordonii parece tener una amplia especificidad de sustrato43 y no pudimos identificar un azúcar que sea utilizado por S. gordonii y que no desencadene la CCR (Lin Zeng, comunicación personal). Se incluyó SsnA purificado como control y ADN degradado en todas las condiciones analizadas, como indica una zona de aclaramiento en el agar. En S. gordonii de tipo salvaje, se observó degradación del ADN en ausencia de azúcares añadidos o en galactosa, pero no en glucosa, maltosa o sacarosa. Curiosamente, se observó actividad de ADNasa en el mutante ∆ccpA cultivado en presencia o ausencia de cualquiera de los azúcares probados (Fig. 2 complementaria). Una cepa complementada genéticamente, S. gordonii ccpAComp, exhibió un patrón similar de actividad de DNasa al tipo salvaje. La eliminación de malR no afectó la actividad de la ADNasa, lo que sugiere que este represor no está involucrado en la regulación de la expresión de ssnA en las condiciones probadas aquí.

Para cuantificar el grado de inhibición del azúcar en la actividad de SsnA, se midió la actividad de la ADNasa de las células cultivadas en medio BHY o BHY suplementado con diferentes azúcares mediante un ensayo basado en fluorescencia (Fig. 4a). La actividad de la ADNasa de S. gordonii se redujo en >50 % en presencia de glucosa, maltosa, galactosa, fructosa o inulina. Los estreptococos producen ácido a partir de los azúcares y es posible que la actividad de la enzima ADNasa se haya visto afectada por el pH de los cultivos. El pH de los sobrenadantes de los cultivos BHY de S. gordonii en fase estacionaria fue de aproximadamente 5,6, mientras que el pH de los cultivos desarrollados con galactosa fue de aproximadamente 4,6 (Fig. 4b). El pH se redujo aún más a entre 4 y 4,2 en cultivos desarrollados con glucosa, maltosa, fructosa o inulina. Para evaluar el impacto del pH bajo en la actividad de la ADNasa, se modificó BHY a pH 5,5 mediante la adición de HCl y se usó para cultivar células de S. gordonii hasta la fase estacionaria. El pH final después del crecimiento fue de aproximadamente 4,2 y casi no se detectó actividad de ADNasa en las células cultivadas en BHY acidificado (Fig. 4).

a Actividad de nucleasa extracelular de S. gordonii DL1 cultivada en BHY o BHY + 2 % (p/v) de azúcares: glucosa (BHYG), maltosa (BHYM), galactosa (BHYGal), fructosa (BHYF) o inulina (BHYI). La actividad de la ADNasa extracelular de las células de S. gordonii cultivadas en medio acidificado BHY/HCl (BHY modificado a pH 5,5 con HCl) se muestra separada por una línea roja. Los puntos de datos se muestran para 3 repeticiones independientes, las barras representan la media y se indica SD. b El pH de los cultivos después del crecimiento hasta la fase estacionaria en BHY, BHY + azúcares o en BHY/HCl. c Los cultivos de S. gordonii DL1 durante la noche se recogieron y se resuspendieron en tampón a pH 7,1 (línea azul), 5,5 (línea roja) o 4,5 (línea magenta). Después de 2 h (flecha roja), las células se recogieron y se resuspendieron en PBS (pH 7,1) o PBS (pH 7,1) suplementado con cloranfenicol (Chlm; 12,5 μg/mL; líneas verde claro y oscuro). Se muestra la actividad de ADNasa para SsnA asociado a células. Los puntos de datos se muestran para 3 repeticiones independientes, las barras representan la media y se indica SD. Se usaron medidas de densidad óptica (OD600 nm) para la normalización en cada ensayo.

Planteamos la hipótesis de que los efectos del pH bajo sobre la actividad de SsnA no se debían directamente a la inhibición de la enzima, ya que el ensayo se realizó después de lavar las células y resuspenderlas en PBS a pH 7,1. Para explorar más a fondo la reducción de la actividad de SsnA mediada por el pH, se incubó S. gordonii DL1 en tampones neutros o ácidos y se transfirió a pH 7,1 en presencia o ausencia del inhibidor de la síntesis de proteínas cloranfenicol (Fig. 4c). La actividad de ADNasa total fue menor en las células incubadas a pH 4,5 o 5,5 que en las células incubadas a pH 7,1. Después de un cambio a pH 7,1, la actividad de SsnA aumentó en las células que se habían incubado en tampón de pH 4,5. La recuperación de la actividad de SsnA se vio afectada en presencia de cloranfenicol, lo que indica que se requería la síntesis de proteínas de novo para restaurar la actividad enzimática. En las células que habían sido incubadas durante 2 h a pH 5,5, la actividad de SsnA aumentó levemente, pero no significativamente, luego de un cambio a pH 7,1. En presencia de cloranfenicol, la actividad de SsnA siguió disminuyendo después de cambiar a pH 7,1, lo que indica que la enzima activa no se estaba restableciendo.

Para caracterizar la actividad enzimática con más detalle, se purificó SsnA como una construcción etiquetada con GST. La identidad de la construcción purificada se confirmó mediante la toma de huellas dactilares de la masa peptídica (Fig. 3 complementaria). En experimentos preliminares, la etiqueta GST se escindió con trombina y se eliminó mediante purificación por afinidad. Se demostró que la enzima es activa con o sin la etiqueta GST (Fig. 4 complementaria). Dado que la eliminación de la etiqueta resultó en una pérdida significativa de rendimiento de la proteína, utilizamos la construcción etiquetada con GST para experimentos posteriores. Inicialmente, se investigaron los efectos del pH sobre la actividad de la ADNasa (Fig. 5a). El pH óptimo estuvo entre 7 y 9,5. No se detectó actividad por debajo de pH 6,5 o por encima de pH 10,5.

a La actividad de nucleasa de SsnA purificada se cuantificó a un pH que oscilaba entre 4,5 y 11. b Con el ensayo de fluorescencia cuantitativo, se analizó la actividad de DNasa de SsnA en presencia de un rango de concentraciones de Mn2+, Ca2+, Mg2+ y Zn2+. Se indican los controles negativos sin enzima. En todos los paneles, los puntos o las barras indican las medias de 3 experimentos independientes y se muestra SE.

Las nucleasas dependen con frecuencia de un cofactor de metal divalente44. El análisis de espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) de SsnA no detectó ningún ion metálico asociado con la proteína purificada. Para determinar los cofactores metálicos preferidos para SsnA, se probó la actividad enzimática de SsnA en presencia de Mn2+, Ca2+, Mg2+ o Zn2+ (Fig. 5b). En ausencia de metales añadidos, no se detectó actividad de ADNasa en las preparaciones de SsnA. La adición de MnCl2 10 µM, CaCl2 20 µM, MgCl2 40 µM o ZnSO4 40 µM dio como resultado altos niveles de actividad de ADNasa. El aumento de la concentración de ZnSO4 a 80 µM condujo a la inactivación casi completa de la ADNasa. La actividad de ADNasa también se anuló en altas concentraciones de MnCl2 (>1,28 mM MnCl2).

Como se muestra arriba, las biopelículas GS-5 de S. mutans fueron sensibles al tratamiento con ADNasa I, mientras que las biopelículas de S. gordonii no lo fueron. Presumimos que SsnA también dispersaría biopelículas de S. mutans preformadas. Usando microscopía de escaneo láser confocal, las biopelículas de S. mutans se eliminaron casi por completo mediante el tratamiento con SsnA (Fig. 6a). Se encontró que la inhibición dependía del pH predominante (Fig. 6b). A pH 4 o 5, SsnA no eliminó las biopelículas. Por el contrario, las biopelículas de S. mutans se redujeron a <40 % de la biomasa de control (sin tratamiento enzimático) con ADNasa I a pH 5. A pH 6, tanto la ADNasa I como la SsnA fueron eficaces para reducir las biopelículas de S. mutans y la biomasa se redujo. a <40% de los controles. La eliminación de la biopelícula fue aún mayor a pH 7, y solo quedó entre el 10 y el 20 % de la biopelícula después del tratamiento con DNasa I o SsnA. Con base en estos hallazgos, planteamos la hipótesis de que las células de tipo salvaje de S. gordonii, que expresan SsnA, podrían dispersar biopelículas de S. mutans GS-5. Para probar esta hipótesis, se trataron biopelículas de S. mutans preestablecidas cultivadas durante 20 h con células de S. gordonii de tipo salvaje o ΔssnA o con medio de cultivo gastado (Fig. 5 complementaria). El tratamiento con células de S. gordonii de tipo salvaje o sobrenadante de cultivo redujo significativamente la biomasa del biofilm de S. mutans a aproximadamente el 60 % del control. Por el contrario, el tratamiento con células S. gordonii ΔssnA no redujo las biopelículas de S. mutans. Se observó una reducción pequeña, pero significativa, en las biopelículas de S. mutans después del tratamiento con sobrenadante de cultivo de S. gordonii ΔssnA (Fig. 5 complementaria). En general, estos datos muestran que SsnA promueve la eliminación de biopelículas de S. mutans por parte de S. gordonii.

a Microscopía de barrido láser confocal de biopelículas preestablecidas de 20 h de S. mutans tratadas con PBS (control) o 5 µg/ml de SsnA durante 1 h a 37 °C. Se usó yoduro de propidio (20 μM) para visualizar las células. Las barras de escala son de 30 µm (paneles izquierdos) o 20 µm (paneles derechos). b Biomasa de biopelículas de S. mutans preestablecidas tratadas con DNasa I (5 µg/mL) o SsnA (5 µg/mL) a pH 4, 5, 6 y 7. Se utilizó el ensayo de cristal violeta para la cuantificación. Los puntos de datos se muestran para 3 repeticiones independientes, las barras representan la media y se indica SD.

Para determinar si SsnA puede controlar el desarrollo de biopelículas orales más complejas, empleamos un sistema de microfluidos BioFlux de entrada dual para cultivar biopelículas de microcosmos orales en presencia o ausencia de SsnA bajo el flujo de saliva natural como única fuente de nutrientes. El sistema se inoculó con saliva no esterilizada para sembrar los canales. Las biopelículas se cultivaron durante 20 h y se tomaron imágenes cada 10 min (Fig. 7a; Película complementaria 1). Se observó una clara inhibición del desarrollo del microcosmos oral durante las 20 h de crecimiento en la mitad del canal en el que se incluyó SsnA. La tinción de ADN extracelular (eDNA) con Yoyo-1 mostró que eDNA también se redujo notablemente en presencia de SsnA. La señal de fluorescencia se cuantificó a lo largo de la formación de biopelículas (Fig. 7b). Se observó un aumento constante en los niveles de eDNA durante 20 h de desarrollo de biopelícula en la mitad superior del canal (control), mientras que en la mitad inferior (complementada con SsnA), los niveles de eDNA se mantuvieron estables durante todo el experimento.

a Visualización de biopelículas de microcosmos orales desarrolladas en el canal del sistema de microfluidos de entrada dual BioFlux con saliva que contiene SsnA (5 µg/mL) alimentando la mitad inferior del canal. Se cultivaron biopelículas de microcosmos durante 20 h. Se usó Yoyo-1 (2,4 nM) para teñir eDNA dentro de la biopelícula. b Cuantificación de la acumulación de eDNA para la sección del canal de crecimiento que contiene SsnA y libre de SsnA durante 20 h. Se tomaron imágenes cada 10 min y se determinaron las cantidades de eDNA usando GrayValue dentro del software FIJI. c Visualización de biopelículas de microcosmos cultivadas en saliva natural suplementada con sacarosa al 0,3 %. Se incluyó SsnA (5 µg/mL) en el depósito que alimenta la mitad inferior del canal. Se incluyó Yoyo-1 (2,4 nM) para la tinción de eDNA. d Cuantificación de la acumulación de eDNA para la sección del canal de crecimiento que contiene SsnA y libre de SsnA durante 20 h de crecimiento en saliva suplementada con sacarosa al 0,3 %. Se tomaron imágenes cada 10 min y se determinaron las cantidades de eDNA usando GrayValue dentro del software FIJI. Se muestran la media y el EE de 3 repeticiones independientes. Las barras de escala son de 50 µm.

Trabajos anteriores habían demostrado que los azúcares provocan una reducción del pH y la supresión de la actividad de la enzima SsnA (Fig. 4). Para evaluar los efectos del azúcar en el control de las biopelículas del microcosmos oral por SsnA, se cultivaron biopelículas en el sistema BioFlux en saliva suplementada con sacarosa al 0,3 % (Fig. 7c; Película complementaria 2). En estas condiciones, no se observó reducción en la acumulación de biopelículas en presencia de SsnA (Fig. 7c, d). Para explorar más a fondo el impacto de la sacarosa en el eDNA en biopelículas de microcosmos orales, se empleó la nucleasa extracelular NucB de Bacillus licheniformis, ya que anteriormente se demostró que controla el desarrollo de biopelículas de microcosmos orales en condiciones estáticas31. En presencia de NucB, el desarrollo de biopelículas en la saliva se inhibió fuertemente en comparación con los controles (Fig. 8a, b; Película complementaria 3). Se observó una inhibición similar en cultivos cultivados en saliva complementada con sacarosa al 0,3% (Fig. 8c, d; Película complementaria 4). En conjunto, los datos anteriores indican que el eDNA es importante para el desarrollo de biopelículas de microcosmos orales y que SsnA no es eficaz para controlar la acumulación de biopelículas dependientes de eDNA en presencia de sacarosa.

a Biopelículas de microcosmos orales cultivadas durante 20 h en saliva natural y complementadas con NucB en la parte inferior del canal microfluídico. Se utilizó colorante Yoyo-1 (2,4 nM) para la visualización de eDNA. b eDNA cuantificado en las dos mitades del canal de crecimiento durante 20 h de crecimiento. El eDNA se midió mediante la determinación de GrayValue en el software FIJI para imágenes tomadas cada 10 min. c Se usó saliva suplementada con sacarosa (0,3 %) para hacer crecer biopelículas de microcosmos y se incluyó NucB en la mitad inferior del canal de crecimiento. d eDNA cuantificado para las mitades que contienen NucB y sin NucB del canal de crecimiento durante 20 h de crecimiento en saliva que contiene sacarosa (0,3 %). Se muestran la media y el EE de 3 repeticiones independientes. Las barras de escala son de 50 µm.

Aquí, identificamos y caracterizamos SsnA, una enzima DNasa asociada a la pared celular extracelular producida por S. gordonii. Las enzimas DNasa extracelulares son ampliamente producidas por especies patógenas de estreptococos y son importantes factores de virulencia39,45,46,47. Varios estreptococos comensales orales, incluidos S. sanguinis, Streptococcus intermedius, Streptococcus oralis, Streptococcus parasanguinis y Streptococcus mitis, producen niveles detectables de actividad de ADNasa extracelular34,41. De estos, solo se ha caracterizado la ADNasa extracelular de S. sanguinis. Se demostró que esta enzima, denominada SWAN (Streptococcal Wall-Anchored Nuclease), media el escape de las trampas extracelulares de neutrófilos (NET)41. Hay evidencia de que S. mutans también puede escapar de los NET utilizando una desoxirribosa aldolasa DeoC48. Sin embargo, la producción de nucleasa extracelular por S. mutans es débil o indetectable en los ensayos de actividad de DNasa34. Nuestros datos han identificado un papel para S. gordonii SsnA en la modulación de la formación de biopelículas por especies competidoras como S. mutans. Además, se demostró que la capacidad de SsnA para mediar en la competencia entre especies dentro de las biopelículas depende del pH y la concentración de azúcares predominantes. Por lo tanto, parece que las ADNasas extracelulares estreptocócicas pueden desempeñar un papel importante en el mantenimiento de la estabilidad de las biopelículas de la placa dental.

SsnA se identificó buscando en el genoma de S. gordonii genes que codifican proteínas con dominios similares a DNasa I. La familia de ADNasa I incluye una amplia gama de nucleasas y fosfatasas que comparten un pliegue proteico conservado49. Aunque nuestro análisis sugiere que la mayoría de SsnA está unida a la célula, un estudio de espectrometría de masas del secretoma completo de S. gordonii reveló la presencia de SsnA (SGO_1651) entre 107 proteínas secretadas50. Por lo tanto, es probable que una parte de la enzima se libere de la superficie celular. Los homólogos de S. gordonii SsnA están presentes en una amplia gama de estreptococos orales, incluidos S. sanguinis, S. intermedius, S. constellatus, S. anginosus y S. parasanguinis (Fig. 6 complementaria), lo que indica que la enzima probablemente desempeña funciones importantes en biopelículas orales. Además, los homólogos relacionados de forma más lejana están presentes en los estreptococos patógenos, incluidos S. pyogenes y los importantes patógenos animales S. suis, S. equi y S. iniae (Fig. 6 complementaria).

La actividad de SsnA se redujo fuertemente en presencia de azúcares. La suplementación con glucosa o los disacáridos que contienen glucosa condujo a la inhibición completa de la actividad de la ADNasa extracelular. Aguas arriba del gen ssnA hay un motivo de secuencia CRE y la regulación se anuló en un mutante ΔccpA. Por lo tanto, es probable que CcpA actúe a nivel de regulación génica para controlar la expresión de ssnA en presencia de glucosa. Desafortunadamente, el mutante ΔccpA creció lentamente en cultivos de caldo y no pudimos obtener datos reproducibles del análisis RT-qPCR de la expresión de ssnA en esta cepa. La regulación de las enzimas DNasa extracelulares por parte de CcpA se ha observado en otras especies de estreptococos, incluidas S. suis y S. pyogenes51,52. En S. gordonii, la CCR es provocada por una amplia gama de azúcares y no pudimos identificar un azúcar que no provoque CCR en S. gordonii43. De hecho, algunos azúcares como la galactosa y la lactosa provocan respuestas reguladoras complejas en S. gordonii que involucran múltiples reguladores además de CcpA53. Es interesante que la galactosa no redujo la actividad de SsnA en un ensayo en placa de agar (Fig. 2 complementaria), mientras que reprimió fuertemente SsnA en cultivos de caldo (Fig. 3). Nuestra hipótesis es que esto puede deberse a vías de regulación que compensan la represión de la expresión de ssnA mediada por CcpA impulsada por galacatosa en cultivos en placas de agar. Será necesario seguir trabajando para identificar las vías reguladoras que controlan la expresión de ssnA en las biopelículas.

La actividad de SsnA también puede haber sido afectada por el pH en el medio de crecimiento. El metabolismo del azúcar condujo a una acidificación del medio de crecimiento a pH < 5,0. La incubación de células a un pH igualmente bajo condujo a una pérdida rápida de la actividad de la ADNasa extracelular que solo se restauró mediante la síntesis de proteínas de novo. Las enzimas de la ADNasa I de mamíferos tienden a tener un pH óptimo relativamente bajo, alrededor de 6,5 a 7, mientras que otros miembros de la familia de la ADNasa I muestran una preferencia por condiciones de pH más altas54. El rango de actividad de pH de SsnA recombinante (6,5 a 10,5) parece ser ligeramente más alto que el homólogo de S. sanguinis SWAN, que es activo de pH 5,5 a 9,0, con actividad máxima a pH aproximadamente neutro41. La incubación de SsnA recombinante en condiciones de pH bajo no condujo a la inactivación irreversible de la enzima, y ​​la actividad se restauró por completo cuando la enzima se cambió a un tampón de pH más alto (Fig. 7 complementaria). Por lo tanto, parece que la inactivación de la SsnA unida a la pared celular después del crecimiento en azúcares o en un medio de bajo pH se debe principalmente a la renovación de la proteína más que a la inhibición directa de la enzima. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el cloranfenicol dará como resultado el cierre general de la síntesis de proteínas, lo que podría afectar indirectamente la actividad de SsnA, por ejemplo, al influir en el pH dentro de las células y en el entorno inmediato.

Además del pH, los iones metálicos son importantes para la actividad de las enzimas de la familia DNase I. Por ejemplo, la actividad de S. sanguinis SWAN se ve reforzada por Mg2+ y Ca2+41. De manera similar, encontramos que Mg2+ o Ca2+ promovieron la actividad de SsnA. Esto sugiere que SsnA puede utilizar cualquiera de estos metales, en lugar de requerir ambos como SWAN o algunas otras enzimas de la familia DNase I. A bajas concentraciones, Mn2+ y Zn2+ también parecían activar SsnA. Sin embargo, la actividad disminuyó notablemente a >64 μM Mn2+ o >40 μM Zn2+. En estos experimentos se incluyeron concentraciones bajas (40 μM) del agente quelante EDTA para eliminar los metales traza asociados con la enzima o el sustrato de ADN. Es posible que Zn2+ desplace Mg2+ o Ca2+ del EDTA, activando indirectamente la enzima. En concentraciones más altas, Zn2+ en particular parece ser un potente inhibidor de SsnA. Esto es coherente con otras enzimas de la familia de ADNasa I, incluida la ADNasa I humana, que son inhibidas por Zn2+55. Por otro lado, especulamos que la disminución de la actividad a concentraciones más altas de Mn2+ puede deberse a una unión significativa de Mn2+ al sustrato de ADN, lo que interfiere con el reconocimiento/interacción de la enzima. Las concentraciones de Zn2+ en la saliva son del orden de 0,2 a 1,2 μM, mientras que el Ca2+ está presente en aproximadamente 0,5 a 2,75 mM y el Mg2+ en 7 a 30 μM56. Estas concentraciones apoyarían potencialmente la actividad de SsnA en las biopelículas orales.

El papel de las enzimas DNasa extracelulares en la mediación de interacciones entre especies en biopelículas estreptocócicas no se ha investigado previamente. Aquí, mostramos que las biopelículas formadas por S. mutans GS-5 dependen de eDNA para la estabilidad. Cuando se cultivó con la enzima NucB DNase, S. mutans NG8 produjo aproximadamente el 20 % de la biomasa del biofilm en comparación con el control (sin NucB), mientras que S. mutans UA159 solo se redujo a aproximadamente el 80 % de la biomasa del control (Fig. 8 complementaria), un nivel que es consistente con otros trabajos publicados24. No está claro por qué algunas cepas son más dependientes del eDNA que otras, aunque este fenómeno también se ha observado para otros estreptococos orales57. Cabe señalar que algunos cultivos de laboratorio de S. mutans GS-5, incluido el nuestro, portan mutaciones en los genes pac y gbpC, lo que conduce a la secreción de la proteína de superficie celular PAc (antígeno I/II) y a la falta de producción de GbpC (proteína C de unión a glucano)58. Se necesitan estudios futuros para determinar si PAc y/o GbpC afectan la dependencia de las biopelículas de S. mutans en eDNA.

La capacidad de SsnA para dispersar biopelículas estáticas de S. mutans GS-5 dependía del pH del medio. A pH 5,0, SsnA no dispersó biopelículas en contraste con la ADNasa I, que retuvo la actividad antibiopelícula. Curiosamente, a pH 6,0, SsnA y DNase I redujeron las biopelículas a aproximadamente un 40 % de los niveles en los controles, lo que indica que ambas enzimas estaban activas en estas condiciones. Por el contrario, la SsnA recombinante no fue activa por debajo de un pH de 6,5 cuando se probó frente a una sonda de oligonucleótido fluorescente. Es posible que el ambiente dentro de las biopelículas pueda amortiguar el bajo pH59. Alternativamente, esto podría deberse a diferencias en la naturaleza del sustrato de ADN. La capacidad de SsnA para controlar las biopelículas de S. mutans a un pH de aproximadamente 6,0 puede ser importante en las condiciones dentro de la cavidad oral, ya que se ha demostrado que las biopelículas de S. mutans contienen menos glucano y dependen más del eDNA cuando se cultivan a pH 6,0 que cuando se cultivan. a pH 7,060. No obstante, la reducción del pH a 5,0 o menos puede representar una estrategia defensiva de S. mutans frente a SsnA. Cabe señalar que la disponibilidad de sacarosa y almidón estimula aún más la liberación de eDNA y la producción de ácido por parte de S. mutans, lo que conduce al establecimiento de una biopelícula estable25. Consistentemente, el crecimiento de S. mutans en biopelículas de especies mixtas que también contienen biopelículas de S. gordonii aumenta en presencia de sacarosa61,62.

La presencia de SsnA inhibió el crecimiento de biopelículas de microcosmos orales de especies mixtas bajo el flujo de saliva humana natural, lo que sugiere que la actividad antibiopelícula de SsnA no es específica de las biopelículas de S. mutans. Además de S. mutans, se ha demostrado que las biopelículas de una sola especie de varios microorganismos orales como S. intermedius y S. sanguinis son sensibles al tratamiento con enzimas DNasa63,64,65. Dado que el desarrollo del biofilm oral se ve muy afectado por las interacciones entre células entre especies66, especulamos que la exclusión de ciertas especies podría tener efectos dramáticos en la acumulación de placa dental. Los efectos nocivos de SsnA en biopelículas orales de especies mixtas son consistentes con los resultados obtenidos del tratamiento de placa dental in situ cultivada con ADNasa I32. Anteriormente, mostramos que la presencia de NucB DNase durante el desarrollo del microcosmos oral conduce a una reducción de la biomasa67. Curiosamente, la diversidad microbiana en las biopelículas orales también se vio afectada. El biofilm desarrollado en presencia de NucB contenía proporciones reducidas de especies colonizadoras tardías anaerobias y proteolíticas como Peptostreptococcus, Porphyromonas y Prevotella31. Se requiere más trabajo para establecer si SsnA inhibe selectivamente ciertas especies dentro de la biopelícula.

Con base en nuestros hallazgos, especulamos que puede ser posible apuntar a la expresión de ADNasas estreptocócicas como SsnA para controlar el crecimiento de la placa dental. Sin embargo, la inhibición de SsnA por pH bajo puede restringir el desarrollo de esta estrategia contra biopelículas cariogénicas. Observamos que SsnA no fue eficaz para controlar el crecimiento de biopelículas en saliva suplementada con sacarosa, posiblemente debido a la producción de ácido por microorganismos dentro de la biopelícula. La producción de glucanos que pueden interactuar con el ADN y estabilizar la matriz68 también puede haber contribuido a la falta de actividad de SsnA en estas condiciones. Estudios adicionales destinados a comprender los mecanismos reguladores que gobiernan la producción y la actividad de SsnA, y los efectos de las ADNas extracelulares microbianas orales sobre la estructura y composición microbiana de la placa dental, podrían conducir al desarrollo de enfoques novedosos para controlar biopelículas de múltiples especies al dirigirse a la matriz extracelular. .

Streptococcus gordonii DL1 (Challis), Staphylococcus aureus FH7 y Streptococcus mutans GS-5 (Tabla complementaria 1) se cultivaron de forma rutinaria en medio BHY (Brain Heart Infusion 37 g/L y 5 g/L de extracto de levadura) a 37 °C anaeróbicamente (10 % de CO2, 10 % de H2 y 80 % de N2 en un Ruskinn BugBox Plus, Ruskinn Technology Ltd, Bridgend, Reino Unido). Como medio sólido se utilizó agar BHY (medio BHY más 15 g/l de Bacto-agar). Cuando fue necesario, se incluyeron los siguientes antibióticos: kanamicina (250 μg/mL), espectinomicina (250 μg/mL) y eritromicina (10 μg/mL para inserciones cromosómicas y 2 μg/mL para plásmidos). Se cultivó Escherichia coli en Lysogeny Broth (Melford Laboratories, Ipswich, Reino Unido) a 37 °C con agitación a 200 rpm.

El ADN intracelular (iDNA) o el ADN extracelular (eDNA) se extrajo según lo descrito por Kreth et al.21. S. gordonii o S. mutans se cultivaron durante la noche en medio TYEG que contenía 10 g de triptona de Bacto, 5 g de extracto de levadura, 3 g de K2HPO4 y 2 g de glucosa por L, ajustado a pH 7,5. Se transfirieron un total de 10 µl a 2 ml de TYEG fresco en pocillos de una placa de plástico de 12 pocillos y los cultivos se incubaron con balanceo suave (20 rpm) durante 72 h con cambios de medio cada 24 h. Se aspiró el sobrenadante y se lavaron los pocillos dos veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4. Después de aspirar el líquido, se agregaron 1,5 ml más de PBS a un pozo y se recogió la biopelícula raspando suavemente con un raspador de cultivo de tejidos. Para proporcionar suficiente biomasa para la extracción de ADN, esta muestra se transfirió a un pozo equivalente y se raspó una biopelícula adicional. En total, se combinaron biopelículas de cuatro pocillos para cada muestra. Las células se recolectaron por centrifugación a 12 000 g, 4 °C, 30 min y el sobrenadante (muestra de eDNA) y el sedimento (que contenía células con iDNA) se almacenaron a -20 °C hasta su posterior purificación.

Para la purificación del eDNA, se añadió un volumen igual de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 25:24:1 y se mezcló por inversión 30–40 veces. Después de la centrifugación a 16.000 g, 4 °C durante 5 min, se recogió la fase acuosa y se repitió la extracción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico. Después de otra centrifugación, se recogió la fase acuosa y se precipitó el ADN añadiendo un décimo de volumen de acetato de sodio 3 M, pH 5,2 y mezclando. Se añadieron dos tercios del volumen de isopropanol y se mezclaron, y el eDNA se sedimentó mediante centrifugación a 16 000 g, 4 °C durante 10 min. Después de lavar con 1 ml de etanol al 100 %, el sedimento se secó al aire y se resuspendió en 20 µl de Tris-HCl 10 mM, pH 8,0.

Para extraer el ADNi, los sedimentos celulares se resuspendieron en 150 µl de tampón de esferoplatación (Tris-HCl 20 mM, MgCl2 10 mM y rafinosa al 26 % (p/v), ajustado a pH 6,8). A esto, se añadieron 1,5 µL de lisozima de un stock de 250 µg mL−1 y 5 µL de mutanolisina de un stock de 10.000 U mL−1 y las muestras se incubaron durante 30 min a 37 °C. Las células se lisaron mediante la adición de 150 μl de solución de lisis T&C que contenía 1 μl de proteinasa K (kit de purificación de ADN Epicenter MasterPure, Epicenter Biotechnologies, Madison, WI, EE. UU.) y se extrajo el ADN siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para identificar posibles homólogos de la familia de ADNasa I en S. gordonii, se identificó la superfamilia de dominios de ADNasa I en la base de datos Superfamily (https://supfam.mrc-lmb.cam.ac.uk/SUPERFAMILY/cgi-bin/scop.cgi? sol=56219). Los miembros de la familia de ADNasa I de S. gordonii se identificaron en "asignaciones de genoma". El gen ssnA y la región promotora se recuperaron del genoma de S. gordonii Challis (acceso a GenBank CP000725.1). Los sitios de unión putativos del factor de transcripción se identificaron usando PePPER69.

Las bacterias se inocularon en 200 μL de medio por triplicado en placas de poliestireno de 96 pocillos. Las placas se incubaron anaeróbicamente a 37 °C durante 20 h. Al realizar ensayos de inhibición de biopelículas, se incluyó ADNasa I bovina o GST-SsnA (5 µg/mL) en el punto de inoculación. Para los ensayos de dispersión, se añadieron enzimas (5 µg/ml) a biopelículas de 20 h de antigüedad y se incubaron durante una hora más a 37 °C. La extensión de la biopelícula se cuantificó utilizando el ensayo de cristal violeta57. Los ensayos de biopelícula se repitieron tres veces de forma independiente. La importancia de las diferencias entre las lecturas de absorbancia se determinó mediante la prueba t de Student para dos muestras.

Se usó una sonda de oligonucleótidos, 5′ HEX-CCC CGG ATC CAC CCC-BHQ2 3′ (PrimeTime probe Integrated DNA Technologies), para la cuantificación de la actividad de DNasa según lo descrito por Kiedrowski et al.70. La sonda (2 μM de la sonda en un tampón que consiste en Tris-HCl 20 mM pH 8) se añadió a 25 μL de una fuente de nucleasa (células o enzima purificada) en un pocillo de una placa de microtitulación de 384 pocillos (Greiner Bio- One, Stonehouse, Reino Unido) y la tasa de cambio de fluorescencia (λex: 530 nm, λem: 590 nm) se midió a 37 °C durante 30 min utilizando el lector de microplacas Synergy HT (BioTek, Swindon, Reino Unido).

La interrupción de ssnA se llevó a cabo reemplazando el ssnA cromosómico con el determinante de resistencia a espectinomicina aad9. Las regiones flanqueantes del gen ssnA se amplificaron por PCR utilizando los cebadores SsnAF1 y SsnAR1 para generar un producto de 484 pb en la región 5 'de ssnA y SsnAF2 y SsnAR2 para generar un producto de 674 pb en el extremo 3' de ssnA. El gen aad9 (782 pb) se amplificó a partir del plásmido pFW5 (Tabla complementaria 1) con los cebadores aad9_SsnAF y aad9_SsnAR. Estas reacciones de PCR se realizaron con Taq Reddymix (Sigma Aldrich, Gillingham, Reino Unido) y condiciones de ciclado de 94 °C, 2 min, 35 ciclos de 94 °C durante 10 s, 56 °C durante 30 s, 68 °C durante 90 s , luego 68 °C durante 7 min y 4 °C de mantenimiento. Los productos de PCR se mezclaron en proporciones equimolares y se amplificaron en una PCR de extensión superpuesta utilizando los cebadores SsnAF1 y SsnAR2 con la mezcla de enzimas Expand Long Range PCR (Sigma Aldrich). El termociclado se realizó de la siguiente manera: 92 °C, 2 min, 10 ciclos de 92 °C, 10 s, 56 °C, 15 s, 68 °C 150 s, 25 ciclos de 92 °C, 10 s, 56 °C, 15 s, 68 °C 150 s y aumentando 20 s por ciclo, luego 68 °C durante 7 min y 4 °C de mantenimiento. El producto resultante se utilizó para la transformación de S. gordonii DL1. Para ello, se cultivó S. gordonii en un frasco de vela a fase exponencial temprana (DO600 nm ~ 0,3) en medio BHY suplementado con 1 µL mL-1 de suero fetal bovino y glucosa al 0,1% (p/v) (BHY/FCS/G ). Después de otros 60 min a 37 °C, los cultivos se dispensaron en alícuotas de 0,8 ml y se añadió aproximadamente 1 µg del producto de PCR. Después de la incubación durante 4 h más, los cultivos se diluyeron y se cultivaron en medio BHY solidificado durante 36 h en un frasco con vela. La interrupción y el reemplazo exitosos del gen ssnA con el gen aad9 se confirmaron mediante secuenciación de ADN.

La interrupción de ccpA se llevó a cabo usando un enfoque similar reemplazando ccpA con el gen de resistencia a la kanamicina kanR. La región aguas arriba de ccpA se amplificó con CcpAF1 y CcpAR1 generando un fragmento de 520 pb y la región aguas abajo de ccpA se amplificó utilizando CcpAF2 y CcpAR2. El gen kanR se amplificó con los cebadores KanR_F y KanR_R usando el vector pK18 (Tabla complementaria 1) como plantilla. Se empleó Gibson Assembly Master Mix (New England BioLabs, Ipswich, Massachusetts, EE. UU.) para la fusión de los fragmentos aguas arriba y aguas abajo de ccpA con el gen kanR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento resultante de 1.795 pb se usó para la transformación de células de S. gordonii. La interrupción y el reemplazo exitosos del gen ccpA con el gen kanR se confirmaron mediante secuenciación de ADN.

La mutagénesis del gen malR se logró reemplazando malR con el casete de resistencia a la eritromicina ermAM. Utilizando los cebadores malRF1 y malRR1, se amplificó un fragmento de 471 pb cadena arriba del gen malR. malRF2 y malRR2 se usaron para amplificar una secuencia de 421 pb en la región corriente abajo del gen malR. Los cebadores malRR1 y malRF2 contenían secuencias complementarias de 17 pb para los cebadores ermAMF2 y ermAMR2. Después de amplificar el casete ermAM de pVA838 (Tabla complementaria 1), los productos de PCR se unieron en una PCR de extensión superpuesta. El producto resultante se utilizó para la transformación de S. gordonii DL1.

Para la complementación génica, se creó el plásmido pssnAComp mediante la amplificación de ssnA usando cebadores SsnA.compF y SsnA.compR y ADN genómico de S. gordonii DL1 de tipo salvaje como plantilla. Los cebadores SsnA.compF y SsnA.compR incluían sitios de enzimas de restricción EcoRI y BamHI, respectivamente. El amplicón se digirió con BamHI y EcoRI y se ligó al vector pDL276 (Tabla complementaria 1) que también se había digerido con BamHI y EcoRI (New England BioLabs). La construcción exitosa de pssnAComp se confirmó mediante secuenciación y se usó para transformar S. gordonii ΔssnA mutante para generar la cepa S. gordonii ssnAComp complementada genéticamente.

El plásmido pccpAComp se generó reemplazando el gen arcR en parcRComp71 con el gen ccpA. Los cebadores CcpA_compF y CcpA_compR se usaron para amplificar el gen ccpA usando ADN genómico de S. gordonii de tipo salvaje como molde, generando un fragmento de 1048 pb. Se usaron cebadores Lin-vecF y Lin-vecR para crear un vector linealizado usando el plásmido parcRComp como plantilla, produciendo un vector lineal de 5797 pb. Se empleó el kit de clonación de ligadura In-Fusion HD PCR (Clontech Laboratories, Mountain View, California, EE. UU.) para fusionar el fragmento de ccpA con la columna vertebral del vector generando pccpAComp. La integridad del plásmido pccpAComp se confirmó mediante secuenciación y pccpAComp se utilizó para la transformación de S. gordonii ΔccpA para generar S. gordonii ccpAComp.

Las manipulaciones genéticas de rutina se llevaron a cabo utilizando los protocolos descritos por Sambrook et al.72 y explicados a continuación. Los plásmidos y los cebadores se describen en la Tabla complementaria 1 y la Tabla complementaria 2.

SsnA se clonó como una construcción de fusión de glutatión S-transferasa (GST). La etiqueta GST se escindió donde fue necesario. El gen ssnA, menos el motivo de anclaje celular LPxTG C-terminal y el dominio de señal de secreción N-terminal, se amplificó utilizando los cebadores ssnA_Pf7 y ssnA_Pr7, creando un producto de 2150 pb. Este producto se clonó en el plásmido pGEX-KT (Tabla complementaria 1) y se transformó en E. coli DH5α. Para la transformación, se produjeron células de E. coli químicamente competentes cultivando E. coli hasta la fase exponencial temprana (OD600 nm ~ 0,3) en 50 mL de LB, recolectando durante 5 min a 5000 rpm y suspendiendo el precipitado en 20 mL de CaCl2 50 mM enfriado con hielo. . Después de reposar en hielo durante 20 min, las células se recogieron mediante centrifugación a 5000 rpm, 4 °C durante 5 min y se suspendieron en 4 ml de CaCl2 enfriado con hielo. Las muestras se distribuyeron en porciones de 300 µL, se añadió ADN y se incubaron en hielo durante 40 min. Las células se sometieron a un choque térmico a 42 °C durante 2 min y se sumergieron en hielo. Los transformantes se recuperaron añadiendo 500 µL de medio SOC precalentado que contenía 20 g L-1 de Bacto triptona, 5 g L-1 de extracto de levadura, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM y glucosa 20 mM, y incubando durante 1 h a 37 °C, 250 rpm antes de esparcir en placas de agar LB selectivas. Luego se transfirió el plásmido pGEX-ssnA a E. coli BL21 (DE3) pLysS (Stratagene, La Jolla, California, EE. UU.). La expresión de GST-SsnA se indujo con β-D-1-tiogalactopiranósido de isopropilo 1 mM (Sigma Aldrich) durante 4 ha 37 °C. Se usó una columna de glutatión Sepharose para eluir GST-SsnA en glutatión 10 mM, fosfato de potasio 50 mM, pH 7,2, DTT 1 mM (Sigma Aldrich). Se realizaron tinciones con SDS-PAGE y Coomassie Brilliant Blue y zimografía para evaluar el tamaño y la actividad de GST-SsnA purificada.

La etiqueta de proteína GST de 26 kDa N-terminal se escindió con trombina. El SsnA purificado se intercambió del tampón de elución al tampón TNC (Tris-HCl 20 mM [pH 7,5], NaCl 50 mM y CaCl2 1 mM) para la escisión óptima de la etiqueta GST. Las muestras se incubaron durante 24 h a temperatura ambiente con 1 U de trombina bovina (Sigma) por cada 0,025 mg de SsnA. La trombina se inactivó mediante la adición de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,3 mM y se incubó a 37 °C, 15 min.

Para el crecimiento de biopelículas de microcosmos de especies mixtas, se recolectó saliva de voluntarios sanos que no habían comido ni bebido (excepto agua) en la última hora y que no habían tomado antibióticos en las últimas 3 semanas. La aprobación ética para la recolección de saliva fue otorgada por el Comité de Ética de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de Newcastle (ref. 1853/519/2020). Cuando fue necesario, la saliva se trató con ditiotreitol, los precipitados se eliminaron mediante centrifugación y la saliva se esterilizó mediante filtración para crear saliva libre de células (SFC)73. El BioFlux 1000 (Fluxion, San Francisco, CA) se empleó para cultivar biopelículas de microcosmos orales de especies mixtas. Antes de la inoculación, los canales de las placas de 24 pocillos de doble flujo BioFlux (Fluxion) se cebaron mediante la adición de 200 μL de saliva libre de células (CFS) y la incubación a temperatura ambiente durante 20 min. Luego se eliminó el exceso de CFS del pozo de salida y se reemplazó con 100 μL de saliva no tratada. El flujo se inició desde la salida hasta la entrada a 1,0 dyn/cm2 durante 6 s. A continuación, la placa se incubó a 37 °C durante 40 min para permitir que tuviera lugar la siembra. Luego, cada uno de los pozos de entrada se llenó con CFS precalentado (a 37 °C) y se inició el flujo a 0,5 dyn/cm2 a 37 °C durante 18 h y se tomaron imágenes cada 10 min. Cuando fue necesario, CFS en los pocillos de entrada se complementó con sacarosa al 2% o enzimas DNasa. Las enzimas ADNasa utilizadas fueron ADNasa I bovina (Sigma Aldrich), Bacillus licheniformis NucB67 y S. gordonii SsnA. Se agregaron a las entradas a una concentración de 5 μM. Para visualizar eDNA, se incluyó colorante Yoyo-1 (LifeTechnologies) 2,4 nM con CFS en ambos pocillos de entrada.

La obtención de imágenes de biopelículas cultivadas en el BioFlux 1000 se llevó a cabo utilizando la estación de trabajo de imágenes BioFlux 1000Z que consiste en un microscopio Zeiss Axio Observer Z1 equipado con un recinto ambiental. Se utilizó una cámara Hamamatsu (ORCA-Flash 4.0 LT: 4,2 megapíxeles con píxeles de 6,5 micras) y BioFlux Montage Software (Fluxion) para la adquisición de imágenes. Las imágenes se analizaron utilizando ImageJ v.1.48 (Institutos Nacionales de Salud)74.

Las imágenes de lapso de tiempo de cada canal se convirtieron en una pila. Cada pila fue auto-umbralizada usando el algoritmo 'Otsu'. Se seleccionó un rectángulo de w = 1000 h = 200 píxeles (tamaño de imagen de stock de 1024 × 1024 píxeles) y se guardó como una región de interés (ROI). La intensidad de píxel promedio (valor de gris medio) se midió para cada corte y se graficó usando el software SigmaPlot 13.0 (Systat Software, San Jose, CA, EE. UU.).

Para la visualización de biopelículas estáticas con microscopía de escaneo láser confocal (CLSM), los cubreobjetos teñidos se enjuagaron con PBS y se invirtieron en un marco de goma lleno de PBS asegurado en un portaobjetos de microscopio. La obtención de imágenes se realizó utilizando un microscopio de barrido láser confocal Nikon A1R equipado con un objetivo CFI PLAN APO VC (Nikon 60x/1.40 Oil). Las imágenes se capturaron con el software NIS-Elements C (v4.4, Nikon) y se procesaron con el software Imaris (v8.2, Bitplane).

La actividad de DNasa extracelular de S. gordonii se evaluó utilizando agar de prueba de DNasa (Sigma Aldrich, Gillingham, Reino Unido). Los cultivos bacterianos se sembraron o mancharon (10 µl) en agar de prueba de ADNasa y se incubaron aeróbicamente durante 48 horas a 37 °C. El ADN en el agar de prueba de ADNasa se precipitó inundando la placa con HCl 1 N.

Para determinar la actividad de la nucleasa de los cultivos bacterianos, los cultivos de toda la noche se lavaron dos veces con PBS a pH 7,1 y se resuspendieron en PBS hasta una densidad óptica, OD600 nm = 1. Luego se midió la actividad de la DNasa para 25 µL de la suspensión celular usando el Synergy HT lector de microplacas (BioTek). Para los experimentos destinados a ensayar la recuperación de la actividad de la ADNasa después de la incubación a pH bajo, se recogieron cultivos de S. gordonii DL1 durante toda la noche cultivados en medio THYE a 37 °C y se resuspendieron en un tampón de pH 4,5 (77,1 g/l de acetato de amonio, 70 mL/L de ácido acético glacial), un tampón de pH 5,5 (96,3 mL de solución I [13,61 g/L KH2PO4 (BDH)] y 3,6 mL de solución II [35,81 g/L Na2HPO4]) y PBS (pH 7,1). Las células se incubaron a temperatura ambiente durante un máximo de 2 h, se lavaron en PBS, se resuspendieron en PBS fresco y se analizó la actividad de DNasa en alícuotas de 25 µl utilizando el ensayo de actividad de DNasa basado en fluorescencia. Después de 2 h, las células se recogieron y se lavaron en PBS a pH 7,1. Los cultivos que se habían incubado en tampones ácidos (pH 4,5 o 5,5) se dividieron en partes iguales antes de la recolección. Una porción se resuspendió en PBS mientras que la otra se resuspendió en PBS que contenía 12,5 µg/mL de cloranfenicol para inhibir la síntesis de proteínas de novo75. Los cultivos se incubaron hasta 2 horas más antes de medir la actividad de la ADNasa.

Al investigar la actividad de SsnA purificado en presencia de metales, se incluyó EDTA 40 µM en las reacciones para quelar los contaminantes metálicos residuales del tampón o asociados con el sustrato de ADN antes de la adición del cofactor metálico putativo. Cuando se empleó este ensayo para determinar el pH óptimo para la actividad de la enzima SsnA, se usaron los siguientes tampones: tampón trihidrato de acetato de sodio (pH 4,5-5,5), Bis-Tris (pH 6,0-6,5), Tris-HCl (pH 7,0-9,0 ) y tampón de ácido 3-ciclohexilamino-1-propanosulfónico (pH 9,7-11,0) (Sigma Aldrich).

Se usó zimografía para evaluar la actividad de SsnA purificada con o sin la etiqueta GST contra el ADN de doble cadena. Las enzimas en tampón de Laemmli se cargaron (sin hervir) en geles SDS-PAGE al 12 % que contenían 100 μg/mL de ADN de esperma de salmón (Sigma Aldrich). Después de la electroforesis, el gel se incubó en un tampón de reactivación de enzimas (Tris-HCl 40 mM, CaCl2 5 mM, MgCl2 5 mM y leche en polvo deslipidada al 3% [Premier International Foods, St. Albans, Reino Unido]) durante 20 h a 37 °C. C. El gel se tiñó con bromuro de etidio (0.5 μg mL−1) por 30 min y se lavó 3 veces por 15 min cada una, en agua destilada. El gel se visualizó bajo luz ultravioleta usando un transiluminador G:BOX (Syngene).

Se mezclaron cuatro ml de cultivo celular con 4 ml de RNAlater (Life Technologies), y los tubos se mezclaron en vórtex durante 5 s y se incubaron a 20 °C durante 5 min. Después de la incubación, las células se recolectaron a 3800 g durante 15 min a 20 °C, se descartó el sobrenadante y los sedimentos se congelaron a -80 °C durante no más de 72 h y se extrajo el ARN76. Las muestras se descongelaron a 20 °C y se resuspendieron en 100 μL de tampón de esferoplatación más mutanolisina a 500 U/mL. Las células se incubaron a 37 °C durante 5 min. El ARN total se extrajo utilizando el kit de purificación de ARN de bacterias Ambion RiboPure (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de ARN se determinaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Nanodrop Technologies, LLC, Wilmington, DE, EE. UU.). El ARN se analizó mediante electroforesis en gel para asegurar la integridad del ARN. Se transcribió inversamente un μg de ARN total de células bacterianas utilizando el kit de transcripción inversa QuantiTect (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se prepararon mezclas de reacción de RT-qPCR que contenían 0,25 μL de muestras de cDNA y QuantiTect SYBR Green mix (Qiagen), 1 μM de cebador directo qRT-ssnAF y cebador inverso qRT-ssnAR (Tabla complementaria 2) en un volumen total de 20 μL. Las reacciones se realizaron por triplicado utilizando QuantStudio 3 (ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) con el siguiente programa de termociclado: desnaturalización inicial a 95 °C por 2 min y 40 ciclos de amplificación a 95 °C por 15 s, 55 °C por 10 s y 72 °C durante 30 s. Se utilizó el Método comparativo de CT (ΔΔCT) para analizar los datos de RT-qPCR, y los datos se normalizaron al gen 16 S rRNA como referencia (Tabla complementaria 2, qRT-16S-F y qRT-16S-F). Las reacciones de RT-qPCR se validaron mediante el análisis de la curva de fusión.

Todos los gráficos se trazaron y las pruebas estadísticas se realizaron utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla California, EE. UU.) versión 9. Los detalles de las pruebas estadísticas se dan en las leyendas de las figuras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos cuantitativos que sustentan las cifras del manuscrito principal están disponibles en el Repositorio de Investigación de la Universidad de Newcastle (https://doi.org/10.25405/data.ncl.21539340). Otros datos están disponibles del autor correspondiente a petición razonable.

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Este trabajo fue financiado por el Premio a la Innovación en el Cuidado Bucal (NSJ) de la Asociación Internacional para la Investigación Dental (IADR) y por The Dunhill Medical Trust (RPGF1810\101) (NSJ/AHN/KJW). KJW fue financiado por el Consejo de Investigación de Biotecnología y Ciencias Biológicas (BB/S006818/1). La financiación de doctorado para CL provino de los Institutos Nacionales de Salud (DE016690). Agradecemos a Ekaterina Kozhevnikova y Philip Hardy por el soporte técnico y al Centro de análisis de proteínas y proteomas de la Universidad de Newcastle (NUPPA) por su asistencia en la purificación de enzimas.

Estos autores contribuyeron igualmente: Nadia Rostami, Robert C. Shields.

Escuela de Ciencias Dentales, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de Newcastle, Newcastle, Reino Unido

Nadia Rostami, Robert C. Shields, Sufian Yassin, Halah Ahmed y Nicholas S. Jakubovics

Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad Estatal de Arkansas, Jonesboro, AR, EE. UU.

escudos de robert c.

Escuela de Odontología de Bristol, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido

Hannah J. Serrage, Catherine Lawler, Jane L. Brittan y Angela H. Nobbs

Departamento de Ciencias Restaurativas, Universidad de Alabama en Birmingham, Birmingham, AL, EE. UU.

sufian yassin

Centro de análisis de proteínas y proteomas, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de Newcastle, Newcastle, Reino Unido

Achim Treumann & Paul Thompson

KBI Biopharma BV, Lovaina, Bélgica

Achim Treuman

Instituto de Biociencias, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de Newcastle, Newcastle, Reino Unido

Kevin J Waldron

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NSJ, NR, AN, AT, KJW y RCS diseñaron experimentos; NR, RCS, SY, CL, JLB, PT y HA realizaron experimentos; NSJ, NR, AN, AT, KJW y RCS analizaron e interpretaron los datos; NR, RCS y NSJ redactaron el manuscrito; todos los autores revisaron críticamente el manuscrito y aprobaron la versión final enviada. NR y RCS contribuyeron igualmente al trabajo.

Correspondencia a Nicholas S. Jakubovics.

La Universidad de Newcastle posee la patente WO2011098579A1 'Compuestos bacterianos de desoxirribonucleasa y métodos para la interrupción y prevención de biopelículas'. No hay otros intereses en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Rostami, N., Shields, RC, Serrage, HJ et al. Competencia entre especies en biopelículas orales mediada por la desoxirribonucleasa SsnA extracelular de Streptococcus gordonii. npj Biofilms Microbiomas 8, 96 (2022). https://doi.org/10.1038/s41522-022-00359-z

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Recibido: 15 noviembre 2021

Aceptado: 21 de noviembre de 2022

Publicado: 12 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-022-00359-z

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