Un organo

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8062 (2023) Citar este artículo

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La monitorización continua de la microfisiología tisular es una característica clave del enfoque de órgano en chip (OoC) para la detección de fármacos in vitro y el modelado de enfermedades. Las unidades de detección integradas son particularmente convenientes para el monitoreo microambiental. Sin embargo, las mediciones sensibles in vitro y en tiempo real son un desafío debido al tamaño inherentemente pequeño de los dispositivos OoC, las características de los materiales de uso común y las configuraciones de hardware externas necesarias para admitir las unidades de detección. Aquí proponemos un dispositivo OoC híbrido de silicio y polímero que abarca la transparencia y la biocompatibilidad de los polímeros en el área de detección, y tiene las características eléctricas inherentemente superiores y la capacidad de albergar componentes electrónicos activos de silicio. Este dispositivo multimodal incluye dos unidades de detección. La primera unidad consta de un transistor de efecto de campo de puerta flotante (FG-FET), que se utiliza para controlar los cambios de pH en el área de detección. El voltaje de umbral del FG-FET está regulado por una puerta acoplada capacitivamente y por los cambios en la concentración de carga muy cerca de la extensión de la puerta flotante, que funciona como electrodo de detección. La segunda unidad utiliza la extensión de la FG como microelectrodo, con el fin de monitorear el potencial de acción de las células eléctricamente activas. El diseño del chip y su empaque son compatibles con las configuraciones de medición de conjuntos de electrodos múltiples, que se usan comúnmente en los laboratorios de electrofisiología. La detección multifuncional se demuestra al monitorear el crecimiento de neuronas corticales derivadas de células madre pluripotentes inducidas. Nuestro sensor multimodal es un hito en el monitoreo combinado de diferentes parámetros fisiológicamente relevantes en el mismo dispositivo para futuras plataformas OoC.

Organ-on-chips (OoC) son dispositivos dinámicos de cultivo de tejidos que pretenden imitar los entornos microfisiológicos de los órganos in vitro. Se han empleado para mejorar la relevancia del modelado de enfermedades y la eficiencia del desarrollo de fármacos1. La integración de microfluidos en chips lidera el campo del análisis de formulaciones químicas celulares2, que es crucial, por ejemplo, para el control de la citotoxicidad3 y el diagnóstico de tumores4. Sin embargo, al recapitular aspectos de la fisiología de los órganos en el chip, se deben tener en cuenta varios aspectos, como las fuerzas mecánicas ejercidas sobre los tejidos, la señalización electrofisiológica entre los tipos de células eléctricamente activas y el seguimiento de las señales biológicas en la matriz extracelular. Estos aspectos de OoC tienen la capacidad de mejorar la confiabilidad del sistema y la relevancia fisiológica5. En este sentido, la monitorización continua y en tiempo real de señales biológicas de cultivos celulares sin técnicas de etiquetado óptico terminal es crucial. Por lo tanto, la integración de múltiples sensores en OoC para mediciones en tiempo real se está convirtiendo en la norma, especialmente para señales ambientales, como el pH o los niveles de oxígeno6, por lo que la detección electroquímica es particularmente conveniente. El rendimiento de las unidades de detección es, por lo tanto, crítico. Para aumentar la amplificación de la señal de salida sin necesidad de circuitos externos, se han implementado transistores de efecto de campo (FET) como sensores electroquímicos para extraer información bioquímicamente relevante7. Según el recubrimiento de los electrodos de transistores, se demostró selectividad hacia analitos específicos, como en el caso de los FET sensibles a iones (ISFET). Los ISFET se han empleado durante más de 50 años para detectar variaciones de carga8. Sin embargo, los ISFET generalmente han necesitado un electrodo de referencia externo y voluminoso, que difícilmente puede integrarse en los dispositivos OoC inherentemente pequeños. Además, el electrodo de referencia generalmente se basa en Ag/AgCl y las variaciones de carga en las proximidades podrían "apagar" el canal9. Además, los sensores basados en FET generalmente se fabrican sobre sustratos no transparentes (p. ej., silicio), lo que los hace inadecuados para emplear en dispositivos OoC10.

Esquema del dispositivo OoC propuesto con detección multimodal integrada. (a) Croquis de la parte frontal. Las flechas rosadas indican las conexiones eléctricas para los FET de puerta flotante que se usan para controlar los cambios de pH, así como la extensión de las puertas flotantes que se usan como microelectrodos para registrar la actividad de las células eléctricamente activas. (b) Bosquejo de la parte trasera. Los electrodos se fabrican en la parte frontal y la membrana de polímero se libera grabando el silicio de la parte posterior, lo que lleva a una estructura similar a un pozo para albergar el analito bajo prueba. (c) Bosquejo de un sensor con terminales etiquetados. (d) Esquema del circuito equivalente del dispositivo cuando se usa como FG-FET. Las capacitancias debidas a la doble capa eléctrica se muestran como \(C_S\) y \(C_A\) en el área de detección. (e) Esquema del principio de funcionamiento del FG-FET. Cuando hay un cambio en la carga neta en las proximidades de la extensión FG, el punto de trabajo del sensor cambiará. Este cambio puede detectarse monitoreando la corriente de drenaje del transistor.

Como alternativa a estos enfoques, se introdujeron los FET modulados por carga orgánica (OCMFET). Estos se basan en puertas flotantes y son biocompatibles y transparentes, lo que los hace ideales para aplicaciones de cultivo de células en chip9,11,12. En este caso, en lugar de usar el electrodo de referencia externo, las puertas flotantes (FG) se acoplaron capacitivamente a una puerta de control (CG) y se usaron sin aplicar voltaje a la terminal FG para establecer el punto de trabajo del transistor. La detección del analito muy cerca de la extensión del electrodo FG se realizó mediante modulación de carga con respecto a la carga neta, que a su vez cambió el punto de trabajo del transistor. A pesar de su distintiva relación señal-ruido, los OCMFET generalmente necesitan la aplicación de valores de alto voltaje para "encender" el transistor. Estos valores pueden alterar la fisiología de la célula, según el modelo de órgano. Además, se informaron cambios en la señal de salida debido a la modulación de carga en los niveles de nA7,12, lo que demuestra una baja sensibilidad.

Aquí presentamos un dispositivo OoC híbrido de polímero de silicio con capacidades integradas de detección eléctrica multimodal (carga y campo) (Fig. 1). El dispositivo combina el rendimiento eléctrico superior del silicio y la biocompatibilidad, suavidad y transparencia de los polímeros. El chip contiene 8 sensores basados en FG-FET, cuyo cuerpo y terminales se encuentran en el marco de silicio periférico (Fig. 1a). La extensión de los FG pasa por la membrana polimérica suspendida central, que constituye el cultivo de tejidos y el área de detección, para rastrear los cambios de pH en tiempo real (Fig. 1b). Aunque el chip contiene 8 sensores basados en FET, para este estudio, solo se usó uno de los sensores para rastrear los cambios de pH, debido a la capacidad actual de la configuración de medición móvil personalizada. El pequeño tamaño del chip y, en particular, el tamaño del área de detección permite monitorear los cambios en un volumen pequeño y mediano (\(\sim 30\,\upmu \hbox {L}\)). Además, dependiendo de la selección de terminales, las extensiones de los electrodos FG se pueden emplear como microelectrodos para controlar la actividad de las células electrogénicas, como las neuronas.

En el dispositivo presentado aquí, los FG no tienen terminales para aplicar voltaje; más bien, están acoplados capacitivamente al entorno y las puertas de control (CG) (Fig. 1c). La primera puerta de control (\(CG_1\)), que está en la parte de silicio, especifica el punto de trabajo del transistor, mientras que el segundo CG (\(CG_2\) en el esquema) completa el circuito y se acopla al electrodo- interfaz de electrolito (Fig. 1d). Un cambio de carga neta muy cerca de la extensión de puerta flotante (también conocida como electrodo sensor) induce un cambio en el voltaje de umbral del transistor y puede monitorearse como el cambio en la corriente de drenaje del transistor; ya que la modulación de carga en el FG induce una polarización correspondiente del dieléctrico de la puerta (Fig. 1e). Este mecanismo de transducción se detalla en otro lugar9,13 y también se basa en la polarización de la extensión. Aunque la polarización perfecta no se puede lograr experimentalmente, no fluye corriente a través de la extensión FG, ya que el FG solo está acoplado capacitivamente y no hay corriente de puerta de fuga, por lo que la polarización es posible14.

Fabricación y embalaje del dispositivo OoC. (a) Pasos principales en la fabricación del sensor. El recuadro morado muestra las dimensiones del dispositivo final, así como la sección transversal. (b) Parte delantera de la viruta después de los pasos de fabricación y troceado. ( c ) Imagen SEM del chip desde la parte posterior. (d) Dispositivo ensamblado y listo para usar. ( e ) Esquema del ensamblaje del chip, con soporte y pozo impresos en 3D y la PCB de diseño personalizado con corte central para acceso a imágenes ópticas.

Entre los órganos humanos, podría decirse que el cerebro tiene la fisiología más compleja, que consta de muchos tipos diferentes de neuronas y células gliales, que interactúan entre sí de manera compleja. El seguimiento de la actividad de las células eléctricamente activas, principalmente las neuronas, puede conducir a la identificación de mecanismos neurobiológicos disfuncionales que subyacen a los fenotipos de la enfermedad. Investigadores de campos interdisciplinarios han estado utilizando electrodos para registros in vivo e in vitro de potenciales de acción15 en varias configuraciones, en particular matrices de microelectrodos (MEA). Los MEA generalmente se implementan para registrar cientos de neuronas al mismo tiempo con un rendimiento relativamente alto, lo que ha demostrado ser una lectura funcional robusta para distinguir entre condiciones sanas y enfermas16. Además, también se ha demostrado que los MEA son adecuados para el descubrimiento y la prueba de fármacos17,18,19,20. Varios tipos de células neuronales y gliales se pueden cultivar en MEA y formar redes neuronales complejas. Estas redes neuronales pueden generar oscilaciones a varias frecuencias (desde 0,05 Hz hasta cientos de Hz21). Existen diferentes tipos de dispositivos MEA, incluidos electrodos 3D desechables22 con estimulación óptica23 y MEA estáticos integrados con espectroscopia de impedancia en un dispositivo microfluídico24 para optimizar la extracción de señales. Aquí, usamos la extensión de los electrodos FG como microelectrodos pasivos, para poder usar nuestro chip como un dispositivo MEA, además de la detección de carga ya descrita.

La reproducibilidad y la estandarización en la fabricación de dispositivos OoC son cruciales para modelos de órganos robustos. Por lo tanto, se utilizaron métodos de fabricación de sala limpia a nivel de obleas basados en BiCMOS para fabricar lotes de chips nominalmente idénticos25. El flujo de fabricación se explica en detalle en la sección "Métodos" y los pasos principales se muestran en la Fig. 2a. El pequeño tamaño de las fichas se puede ver desde el anverso (Fig. 2b) y desde el reverso (Fig. 2c). Para facilitar el manejo de líquidos en el área de detección, se ensamblaron un soporte impreso en 3D y un pozo en la parte superior del chip (Fig. 2d). Además, se diseñaron placas de circuito impreso (PCB) diseñadas a medida compatibles con los sistemas de lectura de matrices de microelectrodos disponibles comercialmente para completar el empaque de los dispositivos (Fig. 2e). Este paquete hace que los chips cumplan con la infraestructura de laboratorio existente y se puedan usar directamente para registros de potencial de acción de celdas eléctricamente activas sin requerir conocimientos técnicos adicionales por parte del usuario final. Además, se desarrolló un analizador de lectura electrónica móvil, compacto y personalizado para mejorar la portabilidad del dispositivo y poder usar sensores FG-FET en entornos relevantes, por ejemplo, incubadoras a \(37\,\,^ {\circ}C\) y \(5\%\) \(CO_2\).

Una de las señales bioquímicas más importantes para monitorear durante el cultivo celular es el pH, ya que los cambios en el pH pueden ser causados por productos del metabolismo celular. Por lo tanto, el pH es un indicador de la viabilidad de las células, así como de ciertos fenotipos de enfermedades9,26, ya que está relacionado con la tasa de acidificación del medio27.

El pH es una medida de la concentración de iones de hidrógeno (\(H^+\), es decir, protones), que aquí se modela como la carga neta. En las últimas décadas se han desarrollado varios modelos para examinar la carga de superficies, aquí usamos doble capa eléctrica (EDL) y unión superficial de especies cargadas28,29. Este modelo se basa tanto en la teoría de enlace del sitio como en la capacitancia eléctrica de doble capa30. En nuestro modelo, los parámetros MOSFET relevantes se extrajeron de las mediciones en seco de los sensores con el Sistema de diseño avanzado (ADS), se implementaron en un código Matlab personalizado y se acoplaron a las ecuaciones para la doble capa eléctrica. Luego se resolvieron las ecuaciones para la dinámica de la puerta flotante y la doble capa eléctrica que se forma debido al electrolito.

En teoría, dado que no hay una aplicación directa de voltaje al FG, la carga atrapada en el FG debería permanecer constante. A partir del principio de conservación de las cargas se puede establecer una relación de carga7,9,12,14. El voltaje FG y, por lo tanto, el cambio en la corriente de drenaje depende de tres variables. La primera variable es la carga superficial (\(\sigma _S\)) debido a la interfaz electrolito-electrodo acoplada a \(CG_2\), que impacta el potencial superficial en el área de detección (\(\Psi _0\)). Esto induce un potencial \(\Psi _S\) = \(-\Psi _0\) a través del metal debajo de la capa de óxido en el área de detección. La segunda variable está relacionada con la carga atrapada dentro del FG (\(Q_0\)), y la última variable depende de \(CG_1\)(Eq. 1). El acoplamiento de \(CG_2\) a través de la membrana PDMS al FG también se incluyó en la ecuación, aunque se calculó que \(C_{PDMS}\) era del orden de \(\approx 10^{-16}F\ ), y por lo tanto despreciable. Estas fuentes se suman para obtener el resultado final del voltaje FG (Fig. 1d). Además, la segunda puerta de control se puede considerar como un pseudoelectrodo de referencia, integrado por medio del flujo de fabricación de sala limpia planar (Fig. 2a). Como resultado, todos los elementos del circuito contribuyen al voltaje FG como la suma de los acoplamientos capacitivos31:

El \(CG_{2}\) (que se muestra en la Fig. 1d) modula el potencial en la superficie de detección. La capacitancia total \(C_{tot}\) incluye la capacitancia parásita entre el FG y el cuerpo de silicio, \(C_{CB}\), la capacitancia de la membrana PDMS, \(C_{PDMS}\), y la capacitancia respectivamente de la superficie de detección y \(CG_1\), \(C_S\) y \(C_{C G_1}\). El potencial en la superficie de detección \(\Psi _S\) depende de \(V_{FG}\), el potencial en el EDL \(\Psi _A\), y las correspondientes cargas superficiales \(\sigma _S\) y \(\sigma _A\) (Ver la sección "Método" para más detalles). La corriente de drenaje en la región de saturación se puede calcular a partir de cambios en el voltaje de umbral:

Donde \(\beta\) es un parámetro de ajuste que se incluye después de los resultados experimentales (explicados en la siguiente sección) y \(\alpha\) es la constante asociada a las características del transistor:

La unión de diferentes iones y moléculas de agua polares en la superficie se puede realizar de diferentes maneras dependiendo de los diferentes materiales. Dentro del código de Matlab, caracterizamos el potencial de superficie en el área de detección para diferentes constantes de disociación de superficie y lo implementamos al voltaje del FG y, por lo tanto, a la corriente de drenaje (Fig. 3a). El cambio de pH modula la formación de carga superficial y, por lo tanto, el cambio de potencial en EDL y la superficie de detección. Estos cambios modulan el cambio en el voltaje de umbral y la corriente de drenaje del FET.

(a) Modelo analítico del sensor con diferentes constantes de disociación. El gráfico 3D muestra el cambio de potencial en la EDL con respecto a diferentes constantes de disociación y pH, y el cambio resultante en la corriente de drenaje. Experimentos con líquidos de calibración de pH: (b) Configuración de detección de pH en tiempo real. La unidad de medición móvil se conectó al chip bajo prueba y el \(I_D\) resultante se monitoreó a través de una conexión Bluetooth en la computadora. (c) Monitoreo continuo de cambios en el pH (rosa = pH 4, verde = pH 7, azul = pH 9). El registro muestra un mayor cambio de corriente de drenaje cuando el valor inicial es mayor en comparación con las otras señales que se muestran en el gráfico. (d) Prueba de saturación en chip. Se añadieron secuencialmente soluciones de pH 4 y pH 9 de volúmenes iguales sin lavado intermedio. Los valores \(I_D\) resultantes son consistentes entre sí, ya que el pH resultante para los 3 eventos es el mismo. (e) Comparación entre la solución analítica y los datos experimentales para el sensor representado en (c). La 'X' representa el valor medio del conjunto de datos experimentales para cada solución de pH probada. (f) Análisis de sensibilidad con pequeños decrementos de pH. La flecha representa el aumento de la acidificación debido a la adición secuencial de líquido de pH 4. Los picos hacia abajo se originan por el impacto del líquido adicional en el área de detección.

La caracterización seca de los FET se describió en otra parte25. Para el monitoreo en tiempo real de diferentes valores de pH, la capa nativa de TiO2 en los electrodos se utilizó como capa selectiva y se desarrolló una unidad de medición compacta y móvil (consulte la sección "Métodos"). Esta unidad proporciona una configuración compacta para mediciones continuas y en tiempo real. La portabilidad y la compacidad son importantes ya que para los OoC el entorno de medición puede ser una incubadora en un laboratorio de biología celular, donde el equipo de lectura externo no es común, indeseable y, por lo tanto, debe minimizarse (Fig. 3b). Antes de introducir los líquidos de calibración de pH, el chip se enjuagó con agua desionizada (DI) y luego se secó. Sin embargo, se espera que una fina capa de moléculas de agua permanezca en la superficie debido a la unión superficial. Esto puede considerarse como el estado inicial del sensor (Fig. 3c, banda negra). Luego, líquidos tampón etiquetados con diferentes valores de pH (4, 7 y 9, AVS TITRINORM, BDH Chemicals) se introdujeron en el área de detección, con la ayuda de una micropipeta (\(\approx \,30\, \upmu\ )L). El orden de introducción de líquidos fue aleatorio, para mostrar la reproducibilidad del sensor bajo prueba. En mediciones consecutivas, los datos mostraron una alta reversibilidad del sensor, lo que significa que después de retirar la solución y enjuagar con agua desionizada, el sensor volvió a su estado inicial en segundos, para la introducción del siguiente líquido (Fig. 3c). Después de cada medición, el líquido probado se eliminó del área de detección con una micropipeta y el chip se enjuagó con agua desionizada para restablecer la lectura del sensor a su línea base. Los picos causados por el manejo del agua DI entre eventos se pueden observar en la Fig. 3c. El tiempo de respuesta promedio del sensor fue de 5,48 s con una desviación estándar de 1,3 s de 15 mediciones (Información complementaria, Fig. S1). Durante el monitoreo de las mediciones, se calculó el tiempo de respuesta del sensor a partir de los instantes en que las lecturas eran estables, antes y después de la actualización del pH de la solución (Información complementaria, Fig. S2) y se mostraron los valores de media y desviación estándar en Información complementaria, Fig. S3. Para la preparación del conjunto de datos de calibración del sensor con valores de pH conocidos, no recirculamos el tampón para evitar cualquier contaminación. Sin embargo, podría ser útil considerar la recirculación después de construir el conjunto de datos de calibración de valores de pH conocidos. Aquí, elegimos un dispositivo de tipo n (nMOS), con \(V_{CG} = 5V,\) \(V_{DS} = 3V,\) \(V_{SUB} = V_S = 0V\) y \ ({V_{CG_2}} = 3.3V.\) Se observó que los valores de la corriente de drenaje disminuyen con el aumento de la acidez, lo cual es consistente con la literatura7, donde para un dispositivo orgánico de tipo p se informó la misma tendencia en la dirección opuesta. Suponemos que el cambio más alto desde valores de pH más bajos se origina en la polarización de la capa de óxido de detección, que detecta la carga opuesta de la capa formada real. A partir de los datos experimentales, concluimos que los valores de corriente de drenaje correspondientes a diferentes líquidos de pH (4, 7 y 9) podrían medirse con unos pocos segundos de tiempo de respuesta (Información complementaria, Fig. S1). A partir de los datos medidos, se obtuvo un valor de sensibilidad \(\frac{\Delta I_{D}}{\Delta pH}\) como \(1.5305\frac{\mu A}{pH}\) para el cambio entre pH 7 y pH 9 y \(1.3574\frac{\mu A}{pH}\) entre pH 7 y pH 4.

Para probar la saturación del dispositivo, sin enjuagar el área de detección, se agregó el tampón de pH 9 después del tampón de pH 4 en un volumen igual. Desde el primer evento en la Fig. 3d, observamos que cuando se introdujo el tampón de pH 4, el aumento de la corriente debido a la adición del tampón de pH 9 fue menor, probablemente debido al hecho de que la superficie del área de detección ya estaba cubierto en su mayor parte con iones H+ de la solución de pH 4. Cuando se limpió el área de detección y se introdujo primero el tampón de pH 9 (segundo y tercer evento), el \(I_D\) inicial aumentó y luego disminuyó con la adición del tampón de pH 4, aunque el cambio en \(I_D\) fue menor cuando el sensor estaba en perfectas condiciones antes de la introducción del líquido. Los valores \(I_D\) resultantes fueron consistentes con los 3 eventos para el mismo pH final (Fig. 3d, banda morada). Para la detección de pH, usamos \(TiO_2\) nativo para que sirviera como capa selectiva32, y las constantes de disociación de la superficie \(pK_A = 8\) y \(pK_B = 4.5\)29,33 para comparar los resultados experimentales con el modelo analítico (Figura 3e). Vimos la misma tendencia para los valores de corriente de drenaje tanto para cálculos analíticos como para experimentos (Tabla 1 de información complementaria). Se introdujo un parámetro de ajuste (\(\beta = 30\) \(10^{-6}\)A) en el modelo y se sumó a los valores de corriente de drenaje para tener en cuenta los parámetros desconocidos, es decir, la capacitancia de la capa de Stern debido a la doble capa eléctrica (calculada en \(C_{Stern} = 1.078 \cdot 10^{-11}F\) con las suposiciones basadas en 28), el espesor real del \(TiO_2\) nativo y la carga atrapada dentro de la FG.

Finalmente, usando otro n-MOS FG-FET en un chip separado, se registraron cambios más pequeños de pH mediante la adición secuencial de 2 y 3 \(\upmu \hbox {L}\) de tampón de pH 4 (disminuyendo el pH inicial del líquido a 4,4 y 4,3, respectivamente) sin enjuagar el área de detección (Fig. 3f). Esta prueba mostró la sensibilidad del sensor para detectar cambios pequeños (0.1) de pH en solución. Los límites inferiores deben investigarse más a fondo con una configuración de medición con resolución de corriente sub-nA, actualmente no disponible para nuestra solución portátil.

Como prueba de concepto del sensor, utilizamos neuronas corticales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) y mostramos la capacidad del sensor para registrar extracelularmente su actividad potencial de acción. Con este fin, introdujimos y usamos picrotoxina, un antagonista \(GABA_A\) no competitivo, para inducir un comportamiento similar a un estallido en nuestro cultivo celular que se puede detectar usando el chip MEA. Antes de registrar la actividad de picos extracelulares, se probó la biocompatibilidad del chip. Las células progenitoras neurales (NPC) se diferenciaron durante 7 días y maduraron durante 2 semanas en el chip antes de fijar y teñir las células. La tinción mostró un marcador de neuronas maduras (\(\beta 3\) tubulina/verde), así como la producción de vesículas sinápticas (sinaptofisina/rojo). La maduración exitosa de las neuronas corticales derivadas de hiPSC confirmó la biocompatibilidad de los chips para mediciones en vivo y no invasivas (Fig. 4a, b).

Para el registro de la actividad de picos extracelulares, utilizamos la configuración de lectura de Multichannel Systems (MCS), que es un sistema comercialmente disponible y de uso común para mediciones de electrofisiología en laboratorios (Fig. 4c). El motivo fue demostrar la compatibilidad con un sistema de lectura estandarizado y la capacidad de nuestro chip para usarse en cualquier laboratorio con este equipo, sin necesidad de conocimientos previos adicionales del usuario final. Diseñamos un PCB que era compatible con la configuración de lectura MCS para el modelo MEA de 60 electrodos. La inclusión de una abertura en el centro de la PCB permite a los usuarios finales tener visibilidad del cultivo celular gracias a la membrana transparente de PDMS (Fig. 4d).

Registramos señales electrofisiológicas espontáneas de neuronas corticales derivadas de hiPSC de un microelectrodo, como prueba de concepto. A partir del procesamiento posterior de la señal grabada, la tasa de disparo promedio fue de 0,9661 Hz. Se añadió picrotoxina al cultivo celular para inducir una condición similar a la epilepsia en el cultivo celular34 y para determinar si el chip podía medir cambios en la señal electrofisiológica de las neuronas. Introducimos la picrotoxina (50 \(\upmu \hbox {M}\)) 20 s después de que se iniciaron las grabaciones, como se puede ver en la Fig. 4e-línea azul. La Fig. 4f muestra un canal representativo que se registró y se demostró que la velocidad de disparo aumentó en promedio (N = 3) de 0,31 ± 0,1 Hz antes de agregar la picrotoxina a 1,38 ± 0,25 Hz después de agregar el fármaco. La producción de señal resultante de las neuronas derivadas de hiPSC que se ven en la Fig. 4f con un evento similar a un estallido (inserción "después de la picrotoxina") es representativa de la exposición a la picrotoxina.

Experimentos de biocompatibilidad y prueba de concepto electrofisiológica: (a, b) neuronas corticales derivadas de HiPSC diferenciadas (7 días) y maduradas (14 días) en el chip. Después de la tinción, son visibles \(\beta 3\) neuronas tubulina positivas (verde) y vesículas sinápticas (roja). (c) Compatibilidad con la configuración de grabación MEA de Multichannel Systems de la PCB y el chip. (d) Recuadro que muestra el chip y el pocillo con medio y células. ( e ) Señal de traza de electrodo único de las grabaciones MEA. (f) La adición de picrotoxina (50 \(\upmu \hbox {M}\)) provocó un aumento en la tasa de incendios.

Hemos demostrado la capacidad del sensor basado en FG-FET para medir cambios locales en el pH y registros de potencial de acción extracelular en el chip.

Nuestro sensor de pH reveló la repetibilidad de la detección mientras cambiaba consecutivamente el líquido bajo prueba, sin saturar los electrodos de detección en períodos de medición de una hora. Es posible identificar el valor de pH de los líquidos debido a sus distintivas huellas dactilares de corriente de drenaje (Fig. 3d). Dependiendo del ancho y largo de los canales de los FETs, se obtuvieron diferentes valores iniciales de voltaje umbral. La diferencia en los valores iniciales de la corriente de drenaje se debe a las diferentes dimensiones de la compuerta y los posibles defectos que pueden surgir durante la fabricación. Sería necesaria la calibración de cada FET con líquidos tampón de pH para obtener la huella dactilar del sensor, antes de probar líquidos en entornos fisiológicamente relevantes. Para los experimentos, luego de medir el punto de trabajo inicial del FET, se monitorearon los valores de los cambios de pH. Las mediciones simultáneas de múltiples electrodos a la vez pueden inducir diafonía entre electrodos y ruido adicional, lo que deteriora la relación señal-ruido. Se puede agregar una capa de aislamiento eléctrico de anillo protector35 durante la fabricación del dispositivo, para garantizar la eliminación de posibles interferencias entre entornos celulares cercanos.

Los FG-FET modulados por carga son muy prometedores, aunque las cargas atrapadas en el FG son muy pequeñas para manipularlas sin el uso de un electrodo de referencia (o pseudoelectrodo). Si es necesario, aplicar voltaje antes de los experimentos directamente en el FG aumentaría las cargas atrapadas en el interior y, por lo tanto, daría como resultado un cambio mayor en el voltaje de umbral. Cuando nuestro sensor híbrido de polímero de silicio se compara con la técnica anterior7,12, empleamos valores de voltaje más bajos y obtenemos cambios más altos en la corriente (\(\upmu \hbox {A}\) en lugar de nA), lo que podría aumentar la viabilidad de la celda. cultivos donde se necesitan largos períodos de cultivo para examinar varios fenotipos bajo prueba. Además, el proceso de fabricación de sala limpia a escala de obleas permite una mayor precisión, reproducibilidad y rendimiento de los sensores, y hace posible integrar múltiples materiales y circuitos más complejos en dispositivos OoC, si se desea. En nuestro dispositivo, el área de detección y los terminales electrónicos están aislados entre sí. Por lo tanto, sin cambiar los materiales intrínsecos (p. ej., óxido de puerta) de los transistores, se pueden aplicar recubrimientos selectivos como un paso de procesamiento posterior36. Este paso de posprocesamiento permite realizar diferentes sensores de carga o afinidad.

Como prueba de concepto, aquí usamos un número bajo de electrodos de registro. Sin embargo, debido a las capacidades de procesamiento de la sala limpia, la cantidad de microelectrodos se puede aumentar sin comprometer el área pequeña del chip (1 \(\hbox {cm}^2\)). El ruido que se puede acoplar a los registros del potencial de acción extracelular es mayoritariamente térmico15.

La actividad de las redes neuronales se puede registrar a diferentes frecuencias, dependiendo de la información que se desee examinar. Para el sensor de pH, se eligió una frecuencia de muestreo de 1 Hz. Aunque los eventos de potencial de acción generalmente ocurren a frecuencias más altas, la misma configuración sin modificaciones también se puede usar para electrofisiología. La actividad electrofisiológica espontánea de las neuronas corticales derivadas de hiPSC se midió con éxito en el chip y, según la necesidad, también es posible registrar los potenciales de campo locales. Dado que los electrodos que se han empleado para este estudio son relativamente grandes en comparación con el tamaño de celda típico (diferentes tamaños, hasta 100 \(\upmu \hbox {m}\)), podrían ser buenos candidatos para el campo local de baja frecuencia. posibles grabaciones. Debido al ruido \(1/f^2\), los electrodos más grandes son más favorables15. Además, las diferencias de potencial en las terminales \(CG_2\) y FG pueden mejorar el campo eléctrico y podrían usarse para examinar el crecimiento direccional de neuritas37 y tal vez incluso determinar la dirección en la que crecerán los axones. Los estudios de galvanotropismo han demostrado que es posible guiar el crecimiento de los axones en función de la intensidad del campo. Este podría ser un enfoque más natural en lugar de usar señales topográficas como surcos para dirigir los axones para imitar, por ejemplo, la organización espacial que se ve en la corteza de los modelos de cerebro en chip38,39,40.

Aunque hemos mostrado por separado el principio de funcionamiento del dispositivo para los dos modos de detección, a saber, el seguimiento de la corriente de drenaje de los FET para distinguir líquidos con diferentes valores de pH y registros del potencial de acción extracelular, en el futuro las mediciones se pueden operar simultáneamente. en el mismo chip, para monitorear tanto la actividad eléctrica como los cambios de pH en condiciones fisiológicamente relevantes. La bimodalidad del sensor integrado revelaría mediciones simultáneas de cambios en la concentración de carga en los medios y potenciales de acción externos de las células, lo que podría revelar información relevante sobre ciertos fenotipos de enfermedades y la viabilidad de las células, sin necesidad de transferir los medios para analizar en un módulo diferente. Las mediciones en tiempo real del cambio de pH de los medios celulares reales a lo largo del tiempo también forman parte del trabajo futuro. Finalmente, el chip se puede integrar fácilmente en plataformas OoC, como la plataforma traslacional de órgano en chip (TOP)41, debido a su tamaño compacto y al uso de la configuración de medición móvil. Esto facilitaría el estudio de múltiples módulos de órganos y el seguimiento de varias señales biológicas con la placa de microfluidos que se puede modelar para diferentes gradientes42 y programar para manipulación de fluidos y ensayos bioquímicos43.

El dispositivo se fabrica mediante un flujo de proceso compatible con CMOS a nivel de oblea. Se utilizó una oblea de Si tipo p de 4 pulgadas y 525 \(upmu\)m de espesor, pulida por los dos lados para la fabricación de sensores basados en nMOS mediante un proceso BiCMOS estándar. Después de definir los terminales de fuente y drenaje mediante la implantación de iones, se hizo crecer térmicamente una capa de óxido de puerta de 100 nm de espesor. Se depositó una capa de óxido de 6 \(\upmu\)m de espesor mediante deposición química de vapor mejorada con plasma (PECVD) y se modeló en la parte posterior de la oblea como una máscara dura de grabado (Fig. 2a, 1). Una capa de \(Al/1\%\)Si de 1 \(\upmu \hbox {m}\) de espesor se bombardeó y modeló en la parte frontal para implementar interconexiones eléctricas y compuertas flotantes (Fig. 2a, 2). Se utilizó una capa de óxido de PECVD de 150 nm de espesor como dieléctrico entre los electrodos CG y FG. Luego se recubrió con poliimida (PI, Fujifilm LTC9305, Europe NV, Bélgica) y se modeló como una capa de transición mecánica y aislante para cubrir la mayor parte de la extensión de la puerta flotante en la región de detección OoC (Fig. 2a, 3). Se modeló una capa de Ti de 300 nm de espesor pulverizada para servir como extensiones de CG y FG, así como los microelectrodos utilizados para las grabaciones de potencial de acción (Fig. 2a, 4). Se mezcló polidimetilsiloxano (PDMS, Sylgrad 184, Dow Corning, Midland, MI, EE. UU.) con su agente de curado en una proporción de 10:1, se desgasificó, se revistió por rotación y se curó para servir como una membrana de 20 \(\upmu\)m de espesor. para el área de detección de carga/cultivo de células OoC. Se pulverizó un AlSi de 200 nm de espesor para que sirviera como capa protectora en la membrana PDMS, que luego se liberó grabando el sustrato de Si desde la parte posterior mediante un grabado profundo de iones reactivos (Fig. 2a, 5). La oblea finalmente se cortó en 52 chips cuadrados iguales con una huella de 1 \(\hbox {cm}^2\). Luego se montó un soporte impreso en 3D (MOIIN Tech Clear Resin, Hamburgo, Alemania) y los chips se unieron con cables a PCB de diseño personalizado. Según el terminal de contacto eléctrico del dispositivo, los sensores se pueden utilizar como sensor de carga basado en FET o como microelectrodo para capturar eventos de potencial de acción de células eléctricamente activas. Por último, se pegaron pozos impresos en 3D (diámetro = 6 mm, altura = 7 mm) (MOIIN Tech Clear Resin) con PDMS al área de detección para facilitar el manejo de líquidos (Fig. 2b).

Para analizar el FG-FET se resuelve el sistema de ecuaciones gobernantes en Matlab. Estas ecuaciones resuelven el potencial en la puerta flotante \(V_{FG}\), el potencial en la superficie de detección \(\Psi _S\) y EDL \(\Psi _{A}\), y las correspondientes cargas superficiales \( \sigma _S\) y \(\sigma _{A}\)12.

El potencial en la doble capa afecta la carga superficial \(\Psi _S\) y correlaciona el potencial general de la solución (\(V_{B ulk}\), que se supone que es el mismo que el voltaje aplicado desde \(CG_2\) ) a la superficie. Además, \(CG_2\) altera el potencial en la EDL en la parte superior de la superficie de detección:

La capacitancia debida a \(CG_2\) se calculó asumiendo otra capa de Stern debido a la interfaz electrolito-electrodo y su capa nativa de TiO2. La carga superficial debida a los grupos hidroxilo en la superficie del óxido está relacionada con el número de sitios de unión \(N_s\) y las constantes de disociación de la superficie \(K_*\):

El cambio en el voltaje de umbral aparece a partir de la carga neta en la superficie de detección (\(Q_S\)) y el voltaje de umbral inicial, que se obtiene del CG:

Este sistema de ecuaciones se utilizó para calcular el comportamiento del sensor basado en FG-FET para diferentes valores de constantes de disociación y pH.

Para la detección de pH, se desarrolló una configuración de medición móvil (Fig. 3c). El dispositivo incluye una placa de detección para polarizar el FET de puerta flotante y convertir la señal de corriente de salida en voltaje (ajustado mediante resistencias conmutables para detectar incluso en el rango de nA). Además, se empleó un convertidor de analógico a digital (ADC) de 18 bits para convertir los valores de voltaje a un código digital, y la transmisión de la señal se implementó a través de Bluetooth Low Energy. La señal de salida fue monitoreada por un script de MATLAB, así como por un dispositivo Android.

La línea hiPSC LUMC0114iCTRL01 (hPSCreg número LUMCi003-A)44 se utilizó para derivar células progenitoras neurales (NPC) utilizando el kit de inducción neural STEMdiff SMADi (05835, StemCell Technologies). El chip se trató con plasma (50 W, 50 KHz, 45 s con CUTE Plasma System de Femto Science, Selangor, Malasia) antes de recubrirlo con poli-L-ornitina (P3655, Sigma Aldrich) con una concentración de 100 \(\upmu \)g/mL y se incubó a temperatura ambiente (TA) durante la noche. Al día siguiente, el chip se incubó en \(4\,\,^{\circ }\hbox {C}\) durante 30 min antes de recubrirlo con laminina (\(200\,\frac{\upmu \hbox {g} }{\hbox {mL}}\)) se aplicó. Después de lo cual, el chip se incubó a \(37\,\,^{\circ }\hbox{C}\) durante 2 h. Los NPC se sembraron a una concentración de 100 000 células \(\cdot \hbox {cm}^{-2}\) en el chip y posteriormente se diferenciaron en neuronas corticales durante 7 días utilizando el kit de diferenciación de neuronas del cerebro medio STEMdiff (100-0038, Tecnologías de células madre). Por último, las neuronas corticales derivadas de hiPSC se maduraron y mantuvieron en medios del kit BrainPhys hiPSC Neuron (05795, StemCell Technologies) durante el resto del experimento. Todos los medios se suplementaron con \(1 \%\) penicilina/estreptovidina. Para los experimentos con fármacos, para bloquear la inhibición, se preparó picrotoxina (P1675-1G, Sigma Aldrich) a una concentración de 50 \(\upmu \hbox {M}\) en medio BrainPhys y se añadió 20 segundos después de que se iniciaron los registros.

Se utilizó el sistema MEA2100 (Multi Channel Systems, Reutlingen, Alemania) para registrar la actividad electrofisiológica de las neuronas en el chip con la etapa de calentamiento establecida en \(37\,\,^{\circ }\hbox{C}\). Se tomaron varios registros de 1 min a 10 kHz en los días in vitro (DIV) 21 (es decir, 7 días de diferenciación y 14 días de maduración). Los datos fueron recolectados con un filtro Butterworth High-Pass con una frecuencia de corte de 200 Hz. Los archivos de grabación sin procesar (.msrd) se obtuvieron del sistema MEA2100 y se convirtieron en archivos HDF5 utilizando el software MCS. Utilizamos MEA-ToolBox45 para analizar los datos de MEA en MATLAB 2018b (Mathworks, Massachusetts, EE. UU.). MEA-ToolBox se estableció en el umbral \(5 \cdot RMS\) para la detección de picos y la media se calculó a partir de 3 registros.

Las neuronas corticales derivadas de hiPSC se fijaron en DIV 21 en \(4 \%\) paraformaldehído durante 20 min a temperatura ambiente (TA) y se permeabilizaron con \(1 \%\) Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, EE. UU.) en solución salina tamponada con fosfato (PBS, Sigma-Aldrich) durante 20 min. Después del paso de permeabilización, las células se lavaron tres veces en PBS durante 5 min cada una a temperatura ambiente. A continuación, las células se incubaron con \(1 \%\) albúmina de suero bovino (BSA; n.º 9048468, SigmaAldrich) durante 30 min para bloquear la unión no específica y se lavaron de nuevo en PBS tres veces durante 5 min cada una a temperatura ambiente. Los anticuerpos principales utilizados fueron \(\beta 3\) tubulina (policlonal de conejo PA5-86069, Thermofisher, Waltham, MA, EE. UU.), sinaptofisina (monoclonal de ratón ab8049, Abcam, Cambridge, Reino Unido). Estos anticuerpos primarios se diluyeron 1:200 en \(1 \%\) BSA en dPBS (no contiene magnesio ni calcio) y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos secundarios fueron Texas red (Goat anti-mouse, ab7066, Abcam) y Alexa Fluor®488 nm (Goat anti-rabbit, ab150077, Abcam) que se diluyeron 1 : 500 en \(1 \%\) BSA en dPBS. Estos anticuerpos secundarios se incubaron durante 1 ha TA en la oscuridad antes de lavarlos con PBS tres veces durante 5 min cada uno. Los núcleos celulares se tiñeron con NucBlue (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) durante 20 min. Las imágenes fluorescentes se tomaron utilizando un sistema de microscopio Keyence BZ-810 (Osaka, Japón).

Los conjuntos de datos generados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente. Los conjuntos de datos analizados se incluyen en este artículo publicado.

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Los autores desean agradecer al personal del Laboratorio Else Kooi de TU Delft por su apoyo. Este trabajo fue apoyado por la Iniciativa Organ-on-Chip de los Países Bajos, un proyecto de gravitación NWO financiado por el Ministerio de Educación, Cultura y Ciencia del gobierno de los Países Bajos (024.003.001).

ECTM, Departamento de Microelectrónica, Universidad Tecnológica de Delft, Delft, 2628 CD, Países Bajos

Hande Aydogmus, Lovro Ivancevic, Pasqualina M. Sarro & Massimo Mastrangeli

Departamento de Genética Humana, Centro Médico de la Universidad de Leiden, 2333 ZC, Leiden, Países Bajos

Michel Hu, Jean-Philippe Frimat y Arn MJM van den Maagdenberg

Departamento de Neurología, Centro Médico de la Universidad de Leiden, 2333 ZC, Leiden, Países Bajos

Michel Hu, Jean-Philippe Frimat y Arn MJM van den Maagdenberg

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MM y HA propusieron y diseñaron la investigación y escribieron el manuscrito. LI desarrolló el sistema de medición móvil. HA fabricó el dispositivo y realizó caracterizaciones eléctricas. JPF y MH realizaron todos los experimentos de cultivo celular y registraron y analizaron los datos de MEA. JPF y MH también contribuyeron a escribir para la sección de electrofisiología y comentaron el manuscrito. AMJMvdM, PMS y MM comentaron el manuscrito y proporcionaron información adicional. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Hande Aydogmus.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Aydogmus, H., Hu, M., Ivancevic, L. et al. Un dispositivo de órgano en chip con sensores de carga integrados y microelectrodos de grabación. Informe científico 13, 8062 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34786-5

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Recibido: 04 Agosto 2022

Aceptado: 08 mayo 2023

Publicado: 18 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34786-5

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